Slit2-Robo1參與骨癌痛形成的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　骨癌痛(Bonecancerpain,BCP)是原發(fā)性或者轉(zhuǎn)移性骨腫瘤引起的慢性疼痛。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全世界每年新增1000萬癌癥患者,約三分之一的惡性腫瘤會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。絕大部分骨腫瘤患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的慢性疼痛。由于目前對(duì)骨癌痛機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足以及臨床現(xiàn)有治療措施的局限性,約50％的骨癌患者疼痛未得到有效控制。長(zhǎng)期慢性疼痛給患者及其家人帶來巨大痛苦,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,甚至使患者喪失生活自理能力。所

2、以,對(duì)骨癌痛機(jī)制的深入研究,以期為癌痛治療提供有效的治療措施,是目前亟待解決的重大問題。
　　基于對(duì)多種骨癌痛動(dòng)物模型的研究,目前對(duì)骨癌痛的獨(dú)特機(jī)制有了初步了解,認(rèn)為骨癌痛與其它慢性疼痛不同,涉及多種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、多種受體和離子通道,既有炎性痛,又有神經(jīng)病理性疼痛的成分。要破解骨癌痛發(fā)生這個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò),沿用傳統(tǒng)的研究方法,從單一基因、或單個(gè)因素入手是無法解釋和闡明這些現(xiàn)象的本質(zhì)及其相互之間的因果關(guān)系并取得突破性進(jìn)展的

3、。
　　利用基因組學(xué)為平臺(tái),應(yīng)用基因芯片分析技術(shù),可以從細(xì)胞、組織、器官和生物體整體水平上研究結(jié)構(gòu)和功能各異的各種分子及其相互關(guān)系,能夠定量描述和預(yù)測(cè)生物功能、表型和行為,能客觀真實(shí)地反映機(jī)體的整體變化。因此,本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用寡核苷酸微陣列芯片及生物信息學(xué)技術(shù),研究骨癌痛模型與神經(jīng)病理性痛模型、炎性痛模型大鼠脊髓水平基因表達(dá)譜差異,篩選出―脊髓組織骨癌痛特異性基因‖,進(jìn)而利用計(jì)算生物學(xué)方法,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中聚類分析,探討骨癌痛發(fā)生發(fā)展過程

4、中脊髓組織分子水平的改變與疼痛行為學(xué)的關(guān)系,發(fā)掘在骨癌痛發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用的特異基因表型。
　　中樞敏化是指脊髓和脊髓以上部位對(duì)疼痛信號(hào)傳導(dǎo)的放大過程,是目前解釋神經(jīng)病理性疼痛,炎性痛等多種慢性疼痛出現(xiàn)痛覺過敏和痛覺超敏的主要理論。臨床資料和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提示,脊髓水平的中樞敏化是骨癌痛產(chǎn)生和維持的重要機(jī)制。在脊髓水平,背角是疼痛的調(diào)制主要部位,也傷害性信息的初級(jí)整合中樞。外周傷害性信息經(jīng)初級(jí)傳入纖維傳入背角后,在此中繼、整合,再

5、由投射神經(jīng)元向上位腦結(jié)構(gòu)傳遞,最終產(chǎn)生痛覺。因此,目前對(duì)疼痛形成中脊髓敏化的研究也多集中在背角部位。
　　突觸傳導(dǎo)的可塑性改變是疼痛產(chǎn)生過程中脊髓敏化的重要機(jī)制之一。突觸可塑性是指突觸效能在某些因素的作用下出現(xiàn)不同程度的增強(qiáng)或減弱的特性。突觸的可塑性改變包括兩方面,一個(gè)是對(duì)現(xiàn)有突觸結(jié)構(gòu)的修飾,改變突觸遞質(zhì)的釋放而增強(qiáng)或減弱突觸的傳導(dǎo)性能,另一個(gè)是長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性調(diào)節(jié)機(jī)制,是通過增加或減少突觸的數(shù)量來調(diào)節(jié)突觸的傳遞效能。有研究報(bào)道,

6、突觸重塑導(dǎo)致脊髓敏化是骨癌痛發(fā)生的重要因素,但突觸重塑的方式及其具體機(jī)制都不清楚。由于骨癌痛是一個(gè)長(zhǎng)期慢性進(jìn)展的過程,突觸重塑過程也將是一個(gè)長(zhǎng)期的持續(xù)變化,因此我們假設(shè)骨癌痛脊髓敏化是通過增加興奮性突觸數(shù)量來實(shí)現(xiàn)突觸傳遞增強(qiáng)的。但是,新的突觸的形成需要神經(jīng)元軸突或樹突延伸以及有導(dǎo)航作用的分子引導(dǎo)新生突起精確對(duì)接才能完成,而這個(gè)過程的分子機(jī)制也不清楚。
　　Slithomolog2protein(Slit2)是一種神經(jīng)軸突的導(dǎo)向分子

7、,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程有重要作用。能夠刺激神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和延伸以及側(cè)支的形成[28-30],調(diào)控神經(jīng)元遷移,并且通過對(duì)生長(zhǎng)錐的導(dǎo)向而指導(dǎo)突觸的形成和功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立。Roundabouthomolog1(Robo1)屬于細(xì)胞粘附分子免疫球蛋白超家族成員,是slit2的受體,通過與slit2結(jié)合對(duì)神經(jīng)元和生長(zhǎng)錐產(chǎn)生排斥作用,參與調(diào)控發(fā)育中的中樞神經(jīng)軸突定向延伸,促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和調(diào)控神經(jīng)纖維束化、定位以及突觸的形成。研究顯示Slit2和Ro

8、bo1可能在病理狀態(tài)下參與神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)性重塑過程。因此我們假設(shè),在骨癌痛形成過程中,Slit2和Robo1結(jié)合后,發(fā)揮了分子導(dǎo)向作用,促進(jìn)軸突分支靶向性遷移而引導(dǎo)突觸形成。為了證實(shí)Slit2和Robo1結(jié)合導(dǎo)致脊髓中新突觸的形成而誘發(fā)骨癌痛脊髓敏化這一假說,本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠骨癌痛模型,利用RNA干擾技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù),論證Slit2和Robo1在骨癌痛形成中的作用以及對(duì)神經(jīng)元軸突延伸和突觸形成的影響。以期從一個(gè)全新的角度揭示骨癌痛發(fā)生

9、的機(jī)制,為骨癌痛是治療尋找新的靶點(diǎn)
　　研究方法與結(jié)果：
　　1.骨癌痛大鼠脊髓特異性基因表達(dá)譜的篩選
　　方法：選擇雌性wistar大鼠,隨機(jī)分為4組:正常組,骨癌痛組,神經(jīng)病理性疼痛組和炎性痛組。分別制作乳腺癌細(xì)胞脛骨種植的骨癌痛模型,L5脊神經(jīng)結(jié)扎的神經(jīng)病理性疼痛模型和弗氏完全佐劑(CFA)足底注射的炎性痛模型。模型建立后,進(jìn)行痛閾測(cè)定。在疼痛發(fā)展的不同時(shí)期分別取各組大鼠脊髓腰L4-6進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。采用統(tǒng)計(jì)分

10、析篩選表達(dá)差異的基因譜,結(jié)合聚類分析和分子注釋功能數(shù)據(jù)庫(kù)分析特異基因之間的相互作用,模擬疼痛的分子路線圖。
　　結(jié)果：基因芯片檢測(cè)結(jié)果提示在炎性痛早期,有2245個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中包括479個(gè)基因僅在早期表達(dá)上調(diào),515個(gè)基因持續(xù)上調(diào)至疼痛進(jìn)展期,有1093個(gè)基因則在整個(gè)炎性痛發(fā)生發(fā)展過程中是持續(xù)上調(diào)。在疼痛的進(jìn)展期共有2089個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中263個(gè)基因僅在這個(gè)時(shí)間段上調(diào),另外有118個(gè)基因從疼痛進(jìn)展期出現(xiàn)上調(diào),并持續(xù)至后

11、期。在炎性痛的后期有1679個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中有310個(gè)基因僅在后期出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。
　　神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓組織基因芯片檢測(cè)結(jié)果提示在疼痛早期,有1570個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中包括227個(gè)基因僅在早期表達(dá)上調(diào),301個(gè)基因上調(diào)持續(xù)至疼痛進(jìn)展期,有884個(gè)基因則在整個(gè)神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中持續(xù)上調(diào)。在疼痛的進(jìn)展期共有1560個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中265個(gè)基因僅在進(jìn)展期上調(diào),另外有110個(gè)基因從疼痛進(jìn)展期開始出現(xiàn)持續(xù)表達(dá)上調(diào)。在

12、神經(jīng)病理性疼痛的維持期有1476個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中有342個(gè)基因在疼痛維持期才出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。
　　骨癌痛基因芯片的結(jié)果提示在骨癌痛早期,有1383個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中包括381個(gè)基因僅在早期表達(dá)上調(diào),155個(gè)基因上調(diào)持續(xù)至疼痛進(jìn)展期,有691個(gè)基因則是在骨癌痛發(fā)生發(fā)展過程中是持續(xù)上調(diào)。在疼痛的進(jìn)展期共有1740個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中414個(gè)基因僅在這個(gè)時(shí)間段上調(diào)達(dá),另外有480個(gè)基因從疼痛進(jìn)展期開始出現(xiàn)持續(xù)表達(dá)上調(diào)。在骨癌痛的維持

13、期則有1908個(gè)基因表達(dá)上調(diào),其中有581個(gè)基因在疼痛的維持期出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)
　　綜合分析三種大鼠疼痛模型基因芯片分析的結(jié)果顯示,有352個(gè)基因僅在炎性痛發(fā)生發(fā)展中持續(xù)表達(dá)上調(diào),196個(gè)基因僅在神經(jīng)病理性疼痛的進(jìn)展過程中持續(xù)表達(dá)上調(diào),而骨癌痛中有216個(gè)基因持續(xù)表達(dá)上調(diào)。有344個(gè)基因在三種慢性疼痛進(jìn)展中均持續(xù)表達(dá)上調(diào)。
　　2.Slit2/Robo1促進(jìn)興奮性突觸形成誘發(fā)骨癌痛
　　方法：選擇雌性wistar大鼠,隨機(jī)

14、分為5組:假手術(shù)組(Sham),骨癌痛組(BCP),對(duì)照病毒組(BCP+NC-LV),Slit2干擾病毒組(BCP+siSlit2-LV)和Robo1干擾病毒組(BCP+siRobo1-LV)。建立骨癌痛模型并進(jìn)行脊髓內(nèi)病毒注射。模型建立成功后進(jìn)行痛閾測(cè)定。3W后處死動(dòng)物進(jìn)行取出,用HE染色觀察腫瘤細(xì)胞侵犯脛骨情況。用免疫組化多重標(biāo)記法結(jié)合RT-PCR和Westernblot檢測(cè)大鼠脊髓腰膨大部分Slit2,Robo1,Rhoa的表達(dá);

15、用免疫共沉淀檢測(cè)Slit2和Robo1之間的直接作用;用電鏡檢測(cè)脊髓背角突觸形成情況;用免疫組化雙標(biāo)結(jié)合RT-PCR和Westernblot檢測(cè)背角興奮性突觸的形成及相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)情況。
　　結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞接種的大鼠脛骨骨髓腔中有大量的癌細(xì)胞,癌細(xì)胞向骨質(zhì)擴(kuò)散,突破骨髓腔,隨著病程延長(zhǎng),癌細(xì)胞骨質(zhì)侵犯進(jìn)行性加重,后期可出現(xiàn)病理性骨折。機(jī)械痛閾測(cè)定結(jié)果顯示,癌細(xì)胞接種后第9天,大鼠接種癌細(xì)胞側(cè)的后肢出現(xiàn)痛閾下降,隨

16、病程進(jìn)展疼痛進(jìn)行性加劇,癌細(xì)胞接種對(duì)側(cè)后肢痛閾沒有改變。siSlit2-LV明顯緩解大鼠骨癌痛的癥狀,而Robo1則顯著加劇疼痛。免疫組化結(jié)果提示Slit2,Robo1和Rhoa均廣泛共表達(dá)在脊髓背角的神經(jīng)元上。定量實(shí)驗(yàn)分析顯示在骨癌痛大鼠脊髓背角中Slit2表達(dá)上調(diào),Robo1和Rhoa表達(dá)下調(diào);RNA干擾慢病毒成功的下調(diào)大鼠脊髓背角中Slit2和Robo1的表達(dá)。而且siSlit2-LV下調(diào)Slit2表達(dá)的同時(shí)導(dǎo)致Robo1和Rho

17、a的表達(dá)上調(diào),siRobo1-LV顯著下調(diào)Robo1和Rhoa的表達(dá),但不影響Slit2的表達(dá)。電鏡檢測(cè)突觸數(shù)量和免疫組化雙標(biāo)檢測(cè)突觸標(biāo)記蛋白表達(dá)均提示骨癌痛大鼠脊髓背角興奮性突觸數(shù)量明顯增多,siSlit2-LV可減少骨癌痛大鼠脊髓背角興奮性突觸的形成,而Robo1則明顯增加興奮性突觸的形成。RT-PCR和Westernblot對(duì)突觸標(biāo)記蛋白的定量研究結(jié)果與免于組化一致。
　　3.Slit2/Robo1促進(jìn)軸突延伸誘導(dǎo)興奮性突觸

18、形成
　　方法：原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常組(Normal),對(duì)照病毒組(NC-LV),Slit2干擾病毒組(siSlit2-LV)和Robo1干擾病毒組(siRobo1-LV)。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入慢病毒轉(zhuǎn)染5天后,用熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染情況,用免疫組化多重標(biāo)記法結(jié)合RT-PCR和Westernblot檢測(cè)神經(jīng)元上Slit2,Robo1,Rhoa的表達(dá);利用免疫組化觀察神經(jīng)元形態(tài)變化;用免疫組化雙標(biāo)結(jié)合RT

19、-PCR和Westernblot檢測(cè)神經(jīng)元興奮性突觸形成及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果提示Slit2,Robo1和Rhoa共表神經(jīng)元上。定量檢測(cè)結(jié)果顯示干擾慢病毒成功的下調(diào)神經(jīng)元中Slit2和Robo1的表達(dá)。siSlit2-LV下調(diào)Slit2表達(dá)的同時(shí)導(dǎo)致Robo1和Rhoa的表達(dá)上調(diào),siRobo1-LV顯著下調(diào)Robo1和Rhoa的表達(dá),但不影響Slit2的表達(dá)。siSlit2-LV明顯減少神經(jīng)元軸突的長(zhǎng)度和

20、分支數(shù)量,而Robo1則顯著增加軸突長(zhǎng)度和促進(jìn)軸突分支形成。siSlit2-LV可減少神經(jīng)元興奮性突觸的形成,而Robo1則明顯增加興奮性突觸的形成。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(AnalysisofVariance,ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究總結(jié)：
　　一、主要研究結(jié)果
　　

21、1.利用基因芯片分析了骨癌痛,神經(jīng)病理性痛疼和炎性痛發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)的脊髓基因表達(dá)譜。并篩選出與骨癌痛形成有關(guān)的脊髓特異性基因表達(dá)譜。利用分子功能關(guān)聯(lián)分析,模擬與骨癌痛形成分子網(wǎng)絡(luò)圖。
　　2.骨癌痛大鼠脊髓中Slit2表達(dá)上調(diào),Robo1和Rhoa表達(dá)下調(diào);RNAi慢病毒下調(diào)Slit2表達(dá)則明顯緩解骨癌痛,而下調(diào)Robo1表達(dá)則顯著加劇骨癌痛。
　　3.骨癌痛大鼠脊髓中興奮性突觸數(shù)量明顯增多;RNAi慢病毒下調(diào)Slit2

22、表達(dá)則明顯減少突觸數(shù)量,而下調(diào)Robo1表達(dá)則顯著進(jìn)一步增加突觸數(shù)量。
　　4.RNAi慢病毒下調(diào)Slit2表達(dá)則減少原代培養(yǎng)的神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度和分支數(shù)量,而下調(diào)Robo1表達(dá)則顯著增加突長(zhǎng)度和分支數(shù)量。
　　5.RNAi慢病毒下調(diào)原代培養(yǎng)神經(jīng)元中Slit2表達(dá)則明顯減少興奮性突觸形成,而下調(diào)Robo1表達(dá)則顯著增加突觸形成。
　　二、研究結(jié)論
　　1.骨癌痛和炎性痛以及神經(jīng)病理性疼痛三者的發(fā)生機(jī)制既有共同之處,又

23、有各自的特性。其調(diào)控過程不僅是一個(gè)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)式整合過程,同時(shí)也是一個(gè)動(dòng)態(tài)進(jìn)展的過程,在不同時(shí)期有不同基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　2.骨癌痛大鼠脊髓中Slit2表達(dá)上調(diào),通過與Robo1結(jié)合,抑制Robo1和Rhoa的表達(dá),參與骨癌痛的形成。
　　3.Slit2通過與Robo1直接結(jié)合,抑制Robo1和Rhoa的表達(dá),促進(jìn)大鼠脊髓背角興奮性突觸的形成而導(dǎo)致骨癌痛發(fā)生。
　　4.Slit2通過與Robo1結(jié)合,抑制Robo1和

24、Rhoa的表達(dá),通過促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延伸和分支形成,以及Slit2介導(dǎo)的軸突導(dǎo)向作用誘導(dǎo)興奮性突觸的形成。
　　三、創(chuàng)新之處
　　1.本研究首次分析了分別與骨癌痛、炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的特有的基因表達(dá)譜以及慢性疼痛形成共同的基因表達(dá)譜。擬合了骨癌痛形成過程中的細(xì)胞分子線路圖。
　　2.本研究首次證實(shí)了Slit2抑制Robo1和Rhoa的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延伸和分支形成,介導(dǎo)軸突導(dǎo)向作用促進(jìn)興奮性突

25、觸的形成,導(dǎo)致骨癌痛大鼠脊髓敏化,揭示了新的骨癌痛形成的分子機(jī)制。
　　四、展望
　　1.與慢性疼痛相關(guān)的基因表達(dá)譜的研究,系統(tǒng)全面揭示了慢性疼痛相關(guān)細(xì)胞分子線路圖,為疼痛的機(jī)制研究以及治療靶點(diǎn)的選擇提供了依據(jù),但是相關(guān)基因的數(shù)量龐大,相互關(guān)系復(fù)雜,涉及了多方面的細(xì)胞分子功能。因此,這些分子在疼痛中的確切作用及其相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。
　　2.實(shí)驗(yàn)論證了骨癌痛形成過程中Slit2、Robo1和Rhoa之間的交互作用