NR2B在小鼠骨癌痛中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：建立新的小鼠骨癌痛模型，觀察NMDA受體2B亞基(NR2B)在骨癌痛小鼠前腦扣帶回和脊髓中的表達(dá)及分布情況；明確NR2B與癌痛產(chǎn)生之間的關(guān)系；探討NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.小鼠骨癌痛新模型的制備及評(píng)價(jià)：選用成年雄性C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為4組，模型組(15只)：接種Lewis肺癌細(xì)胞2×106個(gè)；熱滅活組(5只)：接種相同數(shù)目加熱滅活的Lewis肺癌細(xì)胞；PBS組(5只)

2、：接種等容積的PBS液；正常對(duì)照組(5只)：不予任何處理。接種后7天始隔日觀察小鼠自發(fā)痛行為及測(cè)定機(jī)械性觸誘發(fā)痛。第7、15、23天，將小鼠麻醉后行雙側(cè)后肢X線攝片，評(píng)估腫瘤誘發(fā)的骨組織破壞程度。模型組小鼠每次攝片后任選5只取術(shù)側(cè)后肢，各對(duì)照組小鼠最后一次攝片后取術(shù)側(cè)后肢，分別作蘇木素-伊紅(HE)染色觀察骨質(zhì)破壞情況。
　　 2.NR2B在骨癌痛小鼠前扣帶回和脊髓中的分布與表達(dá)：選用成年雄性C57BL/6小鼠81只，隨機(jī)分為3

3、組：癌痛組，假手術(shù)組和正常對(duì)照組。觀察三組小鼠自發(fā)痛行為及測(cè)定機(jī)械性觸誘發(fā)痛。分別于術(shù)后第6、10、14、18、22天各取3只，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B mRNA的表達(dá)。依據(jù)PCR結(jié)果，每組分別于術(shù)后第14、18天各取3只，免疫組化檢測(cè)前扣帶回和脊髓NR2B的分布和表達(dá)；同時(shí)每組另各取3只，于術(shù)后第14、18天行Western Blot檢測(cè)脊髓NR2B蛋白的表達(dá)。
　　 3.脊髓NR2B基因沉默對(duì)小鼠骨癌痛的影響

4、：選用成年雄性C57BL/6小鼠72只，隨機(jī)分為3組：癌痛組，干擾組和干擾對(duì)照組。觀察各組小鼠自發(fā)痛行為及測(cè)定機(jī)械性觸誘發(fā)痛。每組分別于接種后第13、14、15、16、18、22天各取3只，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脊髓NR2B mRNA的表達(dá)。依據(jù)PCR的結(jié)果，于接種后第14和18天每組各取3只，Western Blot檢測(cè)脊髓NR2B蛋白的表達(dá)。
　　 4.MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機(jī)制：選用成年雄性C57B

5、L/6小鼠48只，隨機(jī)分為4組：正常組，癌痛組，干擾組和干擾對(duì)照組。觀察各組小鼠自發(fā)痛行為及測(cè)定機(jī)械性觸誘發(fā)痛。每組分別于接種后第14和18天各取3只，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脊髓NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表達(dá)水平。選取接種后第14和18天的每組小鼠各3只，Western Blot檢測(cè)脊髓NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.小鼠骨癌痛新模型的評(píng)價(jià)：模型組接種后第11天

6、左右出現(xiàn)明顯自發(fā)痛行為，表現(xiàn)為自發(fā)抬足時(shí)間延長；接種后第13天左右出現(xiàn)明顯的觸誘發(fā)痛，表現(xiàn)為50％縮足閾值明顯下降，且持續(xù)整個(gè)觀察期。接種后第23天放射學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)側(cè)股骨下段骨髓腔消失，骨皮質(zhì)中斷、大塊缺損。同時(shí)組織學(xué)可見腫瘤細(xì)胞充滿骨髓腔，且穿破骨皮質(zhì)向外生長，侵犯周圍肌肉組織。行為學(xué)、放射學(xué)、組織學(xué)三方面證實(shí)建模成功。
　　 2.NR2B在骨癌痛小鼠的前扣帶回和脊髓中的分布與表達(dá)：
　　 (1)前扣帶回NR2B的實(shí)

7、時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：接種后第6天、10天，癌痛組NR2B的表達(dá)與假手術(shù)組比較無顯著差異，而癌痛組和假手術(shù)組NR2B的表達(dá)比正常組明顯增高：第14天、18天，癌痛組NR2B的表達(dá)明顯增加，與假手術(shù)組和正常組比較，有顯著差異(p<0.05)，而假手術(shù)組與正常組比較，無顯著差異(p>0.05)；第22天，癌痛組NR2B的表達(dá)下降，與假手術(shù)組和正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LA-6段脊髓NR2B的實(shí)時(shí)熒光定量PCR示：接種后第6天，癌痛組NR2

8、B的表達(dá)與假手術(shù)組比較無顯著差異，而癌痛組和假手術(shù)組NR2B的表達(dá)比正常組明顯增高；第10、14、18、22天，癌痛組NR2B的表達(dá)明顯增加，與假手術(shù)組和正常組比較，有顯著差異(p<0.05)；而假手術(shù)組與正常組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (2)L4-6段脊髓和前扣帶回NR2B免疫組化測(cè)定結(jié)果：癌痛組NR2B主要分布在脊髓背角淺層、中央導(dǎo)水管、前角以及小鼠的前扣帶回，脊髓各層NR2B表達(dá)量在中央導(dǎo)水管、背角淺層、前

9、角依次增多。癌痛組于術(shù)后第14、18天，脊髓和手術(shù)對(duì)側(cè)的前扣帶回區(qū)NR2B陽性細(xì)胞光密度(OD)值與假手術(shù)組和正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而假手術(shù)組與正常組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (3)L4-6段脊髓NR2B表達(dá)的Western Blot檢測(cè)結(jié)果：癌痛組于接種后第14天、18天，脊髓NR2B的表達(dá)明顯增高，與假手術(shù)組和正常組比較，有顯著差異(p<0.05)；而假手術(shù)組與正常組比較，無顯著差異(p>0

10、.05)。
　　 3.脊髓NR2B基因沉默對(duì)小鼠骨癌痛的影響：
　　 (1)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠脊髓NR2B mRNA的表達(dá)：接種后第14天和第18天干擾組小鼠L4-6段脊髓的NR2B mRNA表達(dá)水平比癌痛組明顯降低，其中第14天下調(diào)最明顯，干擾組比癌痛組NR2B的表達(dá)下調(diào)了74％；而干擾對(duì)照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (2)Western Blot檢測(cè)小鼠脊髓NR2B蛋白的表達(dá)：接種

11、后第14和18天干擾組小鼠LA-6段脊髓的NR2B表達(dá)水平比癌痛組明顯降低，其中第18天下調(diào)最明顯，干擾組比癌痛組NR2B表達(dá)下調(diào)了67％；而干擾對(duì)照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (3)干擾組與其他兩組相比，自發(fā)抬足時(shí)間明顯縮短，觸誘發(fā)痛閾值明顯增加，有顯著差異(p<0.05)。
　　 4.MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的NR2B在小鼠骨癌痛中的作用機(jī)制：
　　 (1)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組小鼠LA-

12、6段脊髓的NR2B、SP、c-fos和GFAP基因mRNA的表達(dá)：接種術(shù)后第14、18天癌痛組小鼠脊髓的NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表達(dá)比正常組明顯上調(diào)(p<0.05)；干擾組NR2B、SP、c-fos和GFAP基因表達(dá)比癌痛組顯著降低(p<0.05)；而干擾對(duì)照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 (2)Western Blot檢測(cè)各組小鼠L4-6段脊髓的NR2B、p-ERK、p—p38和GFAP蛋白

13、的表達(dá)：接種后第14、18天癌痛組小鼠脊髓的NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP的蛋白表達(dá)比正常組明顯上調(diào)(p<0.05)；干擾組NR2B、p-ERK、p-p38和GFAP的蛋白表達(dá)比癌痛組顯著降低(p<0.05)；而干擾對(duì)照組與癌痛組比較，無顯著差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細(xì)胞能成功制備小鼠骨癌痛新模型，此模型與人類骨癌痛具有相似性;
　　

14、 2.NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表達(dá)，且同一癌痛模型中觀察到NR2B在L4-L6段脊髓和前扣帶回同時(shí)高表達(dá)，提示在癌痛的產(chǎn)生和維持中不僅激活了脊髓低位中樞，而且有腦部中樞參與；
　　 3.本研究初次發(fā)現(xiàn)NR2B在癌痛模型的L4-6段脊髓前角細(xì)胞表達(dá)呈強(qiáng)陽性，為下一步研究提供了新的思路；
　　 4.PEI/NR2B-siRNA復(fù)合物能特異性的使骨癌痛小鼠脊髓NR2B的表達(dá)明顯下調(diào)；其表達(dá)下調(diào)與小鼠疼痛行為學(xué)減輕相一致，