GRIN2B shRNA的構(gòu)建及其對小鼠NR2B基因沉默效果的實驗研究.pdf

1、目的:
　　1.設計并構(gòu)建小鼠NMDA受體NR2B亞基短發(fā)卡RNA干擾真核表達載體（GRIN2B shRNA）并鑒定。
　　2.通過鞘內(nèi)轉(zhuǎn)染聚乙烯亞胺(PEI)介導的GRIN2B shRNA干擾質(zhì)粒，研究該干擾質(zhì)粒對小鼠NR2B基因表達的影響，探討GRIN2BshRNA干擾質(zhì)粒用于慢性疼痛治療的可行性。
　　方法:
　　1.根據(jù)NMDA受體NR2B亞基mRNA編碼序列，設計并合成針對NR2B亞基的特異性RNA干涉

2、片斷，將其克隆入pYr-1.1質(zhì)粒載體，構(gòu)建NR2B亞基shRNA真核表達載體pYr-1.1-GRIN2B-shRNA，并對其進行酶切和測序鑒定。
　　2.選用成年雄性C57BL/6小鼠60只，隨機分為4組:正常組、生理鹽水組、陰性對照組和PEI-shRNA組。于鞘內(nèi)注射后第7天在小鼠足底皮下注射50μL1％的福爾馬林后對其進行疼痛行為學觀察，并且取小鼠腰段脊髓分別行RT-PCR、Western Blot檢測及免疫組化分析，觀察小

3、鼠脊髓NR2B mRNA、蛋白的表達水平及定位。
　　結(jié)果:
　　1.酶切和測序結(jié)果均證明NMDA受體NR2B亞基短發(fā)卡RNA已經(jīng)插入到質(zhì)粒載體pYr-1.1里。
　　2.疼痛行為學觀察顯示:福爾馬林所致的Ⅰ相期（急性期）的傷害性反應，在各組中均無差別(p＞0.05);與正常組、生理鹽水(NS)組、陰性對照(Scr)組相比，PEI-shRNA組Ⅱ相期（強直期）的傷害性反應顯著減少(p＜0.05)，而正常組、生理鹽水組和

4、陰性對照組比較，無顯著性差異(p＞0.05)。
　　3.PCR及Western Blot檢測小鼠脊髓NR2B mRNA及蛋白的表達顯示:與正常組、NS組和Scr組相比，PEI-shRNA組小鼠L4-6段脊髓的NR2B mRNA及蛋白表達水平明顯降低(p＜0.05)，而正常組、生NS組和Scr組比較，無顯著性差異(p＞0.05)。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示:NR2B主要在小鼠L4-6段脊髓背角淺層表達;與正常組、NS組和Scr

5、組相比，PEI-shRNA組小鼠L4-6段脊髓NR2B陽性的細胞數(shù)明顯減少(p＜0.05)，而正常組、NS組和Scr組比較，無顯著性差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.pYr-1.1-GRIN2B-shRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功，為后續(xù)NR2B作為鎮(zhèn)痛靶點的基因治療奠定了基礎。
　　2.PEI介導的GRIN2B shRNA干擾質(zhì)粒能夠使小鼠脊髓NR2B的表達明顯下調(diào)。
　　3.PEI介導的GRIN2B shR