microR-19a-b調控CUL5并促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲.pdf

1、[目的]微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼調控單鏈小分子RNA。他們代表了一類重要的新的生物調控分子，在許多生物學過程中有著很重要的作用，包括生長、分化、凋亡、病毒感染和癌癥發(fā)展。宮頸癌是全球女性的常見腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展是多基因共同參與，多步驟完成的復雜過程。前期工作利用寡核苷酸微陣列技術檢測了宮頸癌組織及其對應正常宮頸組織中miRNA的表達譜差異，發(fā)現(xiàn)miR-19a、miR-19b在宮頸癌中高表達。本研究應用R

2、eal-time PCR技術驗證了這一結果，然后研究了miR-19a和miR-19b對宮頸癌細胞生長表型的影響，進一步確定miR-19a、miR-19b直接作用的共同靶基因，并尋找miR-19a和miR-19b對宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制。
　　[方法]首先，我們應用Real time PCR技術檢測miR-19a、miR-19b在人類宮頸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達。用WST-1，集落形成實驗和細胞生長曲線等檢測miR-19

3、a、miR-19b對宮頸癌細胞系HeLa和C33A的生長活性的影響。我們用生物信息學方法預測和篩選了miR-19a和miR-19b的候選靶基因CUL5，并且用熒光報告載體實驗驗證了miR-19a和miR-19b對CUL5的直接調控作用。通過Real time PCR技術和Western blot方法在宮頸癌細胞系中檢測miR-19a和miR-19b對CUL5的mRNA和蛋白水平的影響。最后利用挽救實驗過表達CUL5和RNA干擾技術沉默C

4、UL5后，用WST-1實驗、生長曲線實驗、集落形成實驗和Transwell實驗檢測了細胞表型的變化，進一步研究靶基因的功能。
　　[結果]Real time PCR結果顯示，與正常宮頸癌組織相比，癌組織內miR-19a和miR-19b的表達明顯升高，而CUL5的mRNA和蛋白水平明顯降低。Real timePCR和Westem blot的結果表明miR-19a和miR-19b能夠影響CUL5 mRNA和蛋白的表達水平。過表達miR

5、-19a和miR-19b，宮頸癌細胞的增殖能力，侵襲能力和生長能力均增強了，然而封閉miR-19a和miR-19b后，通過誘導CUL5的表達，使得宮頸癌細胞的侵襲，增殖和生長能力受到抑制。熒光報告載體實驗表明，miR-19a和miR-19b能夠通過作用于CUL5基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的特定位點，對其表達進行負性調節(jié)。在宮頸癌細胞中，挽救CUL5與封閉miR-19a和miR-19b對細胞的表型影響一致，而沉默CUL5后與過表達m