S100A9對(duì)硬皮病皮膚成纖維細(xì)胞的激活作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　硬皮病(scleroderma)是一種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度合成并沉積于皮膚和內(nèi)臟器官，造成組織器官纖維化硬化，出現(xiàn)功能障礙的結(jié)締組織病。根據(jù)有無(wú)內(nèi)臟器官累及，本病分為局灶性硬皮病(localized scleroderma，LS)和系統(tǒng)性硬化(systemic sclerosis，SSc)，其中，系統(tǒng)性硬化又按受累范圍、程度、進(jìn)展速度及預(yù)后等，分為肢端型系統(tǒng)性硬化(li

2、mited cutaneous systemicsclerosis，lcSSc)及彌漫型系統(tǒng)性硬化(diffuse cutaneous systemic sclerosis，dcSSc)。雖然大部分患者病情發(fā)展緩慢，但出現(xiàn)四肢皮膚受累而導(dǎo)致指端反復(fù)破潰或關(guān)節(jié)功能障礙者，其日常生活和工作則受到嚴(yán)重的影響;若累及顏面部皮膚，患者會(huì)因美觀受到影響而心理負(fù)擔(dān)加重。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)硬皮病的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)行了大量的研究，取得了較大的進(jìn)展，但至今仍

3、無(wú)特異性藥物治療皮膚硬化，也無(wú)法有效控制病情的反復(fù)。因此深入研究疾病機(jī)制，積極尋找治療硬皮病的新靶點(diǎn)具有重要的社會(huì)意義。
　　S100A9是S100鈣結(jié)合蛋白家族中的重要一員，主要由髓系來(lái)源細(xì)胞如單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和分化早期的巨噬細(xì)胞分泌，與機(jī)體固有免疫功能有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)S100A9是中性粒細(xì)胞的強(qiáng)力趨化劑，能促進(jìn)各類細(xì)胞分泌炎癥因子，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用，與多種炎癥性和自身免疫性疾病關(guān)系密切。目前關(guān)于硬皮病與S10

4、0A9的研究不多，我們通過基因譜芯片掃描發(fā)現(xiàn)硬皮病模型鼠皮膚組織中S100A9基因表達(dá)明顯升高。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)S100A9在硬皮病的發(fā)病過程中是否有致病作用，尚未得到公認(rèn)，值得進(jìn)一步探討。
　　研究目的：
　　明確硬皮病患者外周血和皮膚組織中S100A9的表達(dá)水平，探討其與疾病活動(dòng)性的關(guān)系。
　　觀察S100A9如何參與博來(lái)霉素誘導(dǎo)性小鼠皮膚纖維化的發(fā)生發(fā)展，明確S100A9是否具有致纖維化的作用。
　　在硬皮病

5、患者皮膚成纖維細(xì)胞中研究S100A9對(duì)細(xì)胞增殖、炎癥因子分泌及膠原合成的影響，探討S100A9活化成纖維細(xì)胞的可能機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容與方法：
　　第一部分:
　　收集26例局灶性硬皮病患者(LS)、31例肢端型系統(tǒng)性硬化患者(lcSSc)、57例彌漫型系統(tǒng)性硬化患者(dcSSc)和54例正常人的血樣。運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)血漿中S100A9的含量，并與患者的臨床實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析;用real-time PCR

6、方法檢測(cè)外周血細(xì)胞中S100A9的mRNA表達(dá)量;免疫組化法測(cè)定皮膚組織中S100A9及其相應(yīng)受體RAGE的表達(dá)和分布情況。
　　第二部分:C57BL/6小鼠背部皮下注射不同劑量博來(lái)霉素(0.2 mg/ml或0.3 mg/ml，100μl)，每日上午一次，連續(xù)注射三周。取局部病變皮膚組織，用HE染色和Masson特殊染色鑒定小鼠皮膚病變情況，觀察各組小鼠皮膚纖維化程度。構(gòu)建穩(wěn)定的硬皮病小鼠模型，取造模1、2、3周的小鼠皮膚組織，用

7、real-time PCR和Western blot法檢測(cè)皮膚組織中S100A9含量的變化趨勢(shì)。
　　每日上午給予小鼠背部皮下注射低劑量博來(lái)霉素(0.2 mg/ml，100μl)，每日下午在小鼠皮膚同一部位注射S100A9蛋白(0.5μg)，每日一次，三周后處死小鼠。通過HE染色和Masson特殊染色觀察不同組別小鼠病變皮膚組織病理變化，RT-PCR檢測(cè)小鼠皮膚組織中炎癥因子的表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)小鼠皮膚中α-S

8、MA的含量，羥脯氨酸測(cè)試法測(cè)定皮膚中膠原含量的變化。
　　給予C57BL/6小鼠不同劑量S100A9蛋白(0.1μg，0.25μg，0.5μg)皮下注射，每日一次，連續(xù)三周，通過HE染色和Masson特殊染色觀察S100A9單獨(dú)對(duì)小鼠皮膚組織的影響，評(píng)價(jià)皮膚中炎癥因子、α-SMA和膠原表達(dá)的變化。
　　第三部分:
　　收集系統(tǒng)性硬化患者病變皮膚組織，分離原代成纖維細(xì)胞，用不同濃度S100A9刺激細(xì)胞不同時(shí)間，分別用CC

9、K8和BrdU法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率;以real-time PCR和ELISA法測(cè)定細(xì)胞表達(dá)炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β和HMGB1的水平;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察S100A9對(duì)成纖維細(xì)胞遷移能力的影響;Western blot評(píng)價(jià)細(xì)胞中膠原、α-SMA、RAGE表達(dá)情況以及ERK1/2 MAPK或NF-κB信號(hào)通路的活化情況。
　　為了進(jìn)一步探索S100A9活化成纖維細(xì)胞的具體機(jī)制，分別應(yīng)用抗RAGE抗體、抗TLR4抗體、ERK1

10、/2 MAPK通路抑制劑或NF-κB通路抑制劑預(yù)先處理細(xì)胞，再給予S100A9刺激細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖率、上述炎癥因子分泌水平和細(xì)胞表達(dá)膠原、α-SMA、RAGE水平的變化;進(jìn)一步檢測(cè)博來(lái)霉素誘導(dǎo)性硬皮病模型鼠的皮膚組織中ERK1/2 MAPK、NF-κB信號(hào)通路活化情況，與S100A9處理組相比較，通過體內(nèi)研究驗(yàn)證該機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　第一部分:
　　1.與正常對(duì)照組相比，dcSSc患者血漿S100A9水平明顯升高

11、。伴有肺部累及或肌肉累及或腎臟累及的dcSSc患者血漿S100A9水平明顯高于無(wú)肺部累及或肌肉累及或腎臟累及的患者;抗Scl70抗體或抗組蛋白抗體或抗U1RNP抗體陽(yáng)性的dcSSc患者血漿S100A9水平均高于上述抗體陰性組患者。
　　2.三種類型硬皮病患者外周血細(xì)胞中S100A9 mRNA表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，dcSSc患者S100A9mRNA水平較LS、lcSSc患者顯著升高。
　　3.免疫組化染色顯示硬皮病患者皮膚真

12、皮組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這些炎癥細(xì)胞高表達(dá)S100A9;表達(dá)S100A9或其受體RAGE的成纖維細(xì)胞亦顯著增多。
　　第二部分:
　　1.與生理鹽水組相比，高劑量博來(lái)霉素可明顯誘導(dǎo)小鼠背部皮膚纖維化，皮膚厚度增加，膠原沉積增多，低劑量博來(lái)霉素不能有效誘導(dǎo)小鼠背部皮膚發(fā)生硬皮病樣改變。高劑量博來(lái)霉素造模1、2、3周后，硬皮病模型鼠皮膚組織中S100A9水平逐漸增高，顯著高于生理鹽水對(duì)照組。
　　2.將S100A9與低

13、劑量博來(lái)霉素同時(shí)給藥，發(fā)現(xiàn)S100A9明顯促進(jìn)低劑量博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠背部皮膚發(fā)生纖維化硬化，皮膚厚度顯著增加，皮膚內(nèi)炎癥因子、膠原、α-SMA表達(dá)增多，兩者協(xié)同的促纖維化效應(yīng)更強(qiáng)于高劑量博來(lái)霉素注射組小鼠。
　　3.與對(duì)照組小鼠相比，S100A9皮下注射三周后，可明顯促進(jìn)小鼠背部皮膚真皮層內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，炎癥因子表達(dá)增加;高劑量S100A9處理組小鼠皮膚厚度增厚，低、中劑量S100A9處理組小鼠皮膚厚度改變不明顯。
　　

14、第三部分:
　　1.與對(duì)照組細(xì)胞相比，S100A9對(duì)成纖維細(xì)胞有明顯的促增殖作用;S100A9可顯著上調(diào)成纖維細(xì)胞分泌炎癥因子，并促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)膠原、α-SMA和RAGE增加;S100A9可活化細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2 MAPK和NF-κB信號(hào)通路。
　　2.抗RAGE抗體、ERK1/2 MAPK通路抑制劑和NF-κB通路抑制劑可以明顯下調(diào)S100A9誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和分泌炎癥因子的作用，而抗TLR4抗體對(duì)S100A9的刺激無(wú)阻

15、斷作用。
　　3.與低劑量博來(lái)霉素組相比，S100A9與低劑量博來(lái)霉素同時(shí)給藥可顯著增強(qiáng)小鼠皮膚組織中ERK1/2 MAPK和NF-κB的磷酸化，并促進(jìn)受體RAGE在皮膚中的表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　1.S100A9在系統(tǒng)性硬化患者血漿和皮膚中表達(dá)升高，且血漿蛋白含量與臟器累及和免疫學(xué)指標(biāo)異常有明顯相關(guān)性，提示患者體內(nèi)存在著顯著的炎癥免疫反應(yīng)異常。
　　2.S100A9蛋白可加重博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠皮膚纖維化硬化