炎癥、氧化應激與動脈粥樣硬化的關系及辛伐他汀抗炎、抗氧化作用的研究.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化所致的心、腦血管疾病是目前危害人類健康的首要疾病，其發(fā)病機制過去主要存在脂質浸潤、血栓形成和損傷反應3種學說，1999年Ross提出動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病的理論逐漸取得人們的認同。近年的研究證實，粘附分子、細胞因子、生長因子和金屬蛋白酶參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展的炎癥過程，幾乎所有動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)危險因素都和炎癥過程密切相關。血管粘附蛋白－1是20世紀80年代新發(fā)現(xiàn)的粘附分子，研究證實其在慢性炎癥

2、中被誘導或上調。目前血管粘附蛋白－1在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用研究甚少。核轉錄因子-κB廣泛存在于真核生物中，是一個由復雜的多肽亞單位組成的蛋白家族。近年研究顯示，它與動脈粥樣硬化等心血管疾病密切相關。上述炎癥因子在激活后可促進動脈中膜平滑肌細胞的增殖和遷移，其在動脈粥樣硬化斑塊的形成中起重要作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激在血管病變形成中發(fā)揮重要作用。外源性的ROS刺激可以使配位基誘導的受體快速激活釋放細胞內的O2·-和H2O

3、2，而越來越多的研究證明內源性的ROS可以誘導血管平滑肌細胞原癌基因表達，促進細胞增殖。他汀類藥物是目前治療高膽固醇血癥的一線藥物，研究證明他汀除了降脂作用外還具有抗炎抗氧化等多種作用，這在許多基礎研究和臨床實驗中均得到了不同程度的認識和肯定。但是他汀類對接受氧化應激刺激后的動脈炎癥反應的影響尤其是血管粘附蛋白-1的表達未見報道。
　　目的：
　　1、探討人動脈硬化血管中血管黏附蛋白-1、核因子-κB的表達水平，并分析兩者的

4、相互關系及與動脈硬化發(fā)生發(fā)展的關系；
　　2、研究一定濃度過氧化氫對兔血管平滑肌的作用，探討氧化應激與動脈硬化的關系；
　　3、研究辛伐他汀對過氧化氫誘導的兔血管平滑肌細胞增殖的影響和對血管中血管黏附蛋白-1、核因子-κB表達的影響，探討他汀的抗炎抗氧化作用。
　　材料和方法：
　　1、20例人主動脈血管標本根據HE染色結果分為動脈硬化組（15例）和正常對照組（5例），應用免疫組織化學染色方法檢測血管標本中炎癥因

5、子血管粘附蛋白-1、核因子-κB的表達水平，分析血管粘附蛋白-1、核因子-κB在兩組表達中的差異，并探討其病理意義。數據采用t檢驗和Spearman等級相關分析進行統(tǒng)計學分析。
　　2、兔動脈血管平滑肌細胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細胞進入靜止期，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分別加入濃度為0、1、10、50、100、200μmol/LH2O2，每個濃度設6個復孔，以0μmol/L組為對照。上述各組分別于培養(yǎng)24

6、h、48h、72h后，采用CCK-8法檢測血管平滑肌細胞增殖情況；TBA法檢測培養(yǎng)基中丙二醛含量，數據采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。
　　3、兔動脈血管平滑肌細胞用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細胞進入靜止期，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分為①對照組；②過氧化氫刺激組，加入100μmol/L過氧化氫；③低濃度他汀干預組，加入100μmol/L過氧化氫溶液和辛伐他汀溶液10μmol/L；④高濃度他汀干預組，加入10

7、0μmol/L過氧化氫溶液和辛伐他汀溶液50μmol/L，分別于24h、48h、72h采用CCK-8法檢測血管平滑肌細胞增殖情況；TBA法檢測培養(yǎng)基中MDA含量，劃痕法檢測細胞遷移，實驗終點免疫組化法檢測血管粘附蛋白－1、核因子-κB的表達。數據采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　　1、人主動脈血管標本中炎癥因子的表達血管粘附蛋白-1主要在動脈斑塊中平滑肌細胞中表達，尤以斑塊肩部最為明顯。核因子-κB主要在動脈

8、硬化血管的內皮細胞、炎細胞的細胞核上表達，平滑肌細胞也有表達，少數以未活化的形式位于細胞漿；血管粘附蛋白-1和核因子-κB均顯色為棕黃色，正常血管對照染色核顯藍色。在動脈硬化血管中VAP-1陽性表達細胞計數為(17.54±9.86)/HP，15例中有6例弱陽性表達，9例陽性表達。NF-κB陽性表達率為(28.31±8.62)/HP，其中6例陽性表達，9例強陽性表達。在5例正常血管中VAP-1僅血管外膜輕度著色，NF-κB有少量弱陽性表達

9、或呈未活化狀態(tài)，陽性表達率為（6.35±2.28)/HP。兩組中血管粘附蛋白-1、核因子-κB的表達均有顯著差異（P<0.05）；VAP-1和NF-κB的表達呈明顯正相關（r=0.558，P=0.004）。
　　2、H2O2對VSMC的影響①H2O2對VSMC增殖的影響：10～100μmol/L的H2O2作用不同時間后，隨H2O2濃度的增加，VSMC呈增殖趨勢，與對照相比，H2O2濃度≤100μmol/L作用24h時，各組吸光度值

10、無明顯差異（P>0.05），作用48h、72h后，各組吸光度值顯著上升（P<0.01）；H2O2濃度為200μmol/L時，各時段吸光度值顯著降低（P<0.01）；②H2O2促VSMC生成MDA：作用24h后，H2O2刺激組與對照組相比所測A值無顯著差異；作用48h、72h后，與對照組相比，H2O2刺激組測得的A值隨H2O2濃度的增加而增大，呈劑量依賴性；且作用72h所測A值大于48h（P<0.05）。
　　3、辛伐他汀的抗炎抗氧

11、化作用①抑制兔血管平滑肌細胞的增殖和遷移：加入不同濃度的辛伐他汀作用24h后，他汀干預組與對照組相比無顯著差異（P>0.05）；作用48h后，兩種濃度辛伐他汀組可抑制經過氧化氫誘導的兔血管平滑肌細胞增殖（P<0.01）；作用72h后，兩種濃度辛伐他汀組均顯著抑制兔血管平滑肌細胞增殖（P<0.01），且高濃度辛伐他汀組作用大于低濃度辛伐他汀組（P<0.05）；加入不同濃度的辛伐他汀作用72h后可顯著抑制由過氧化氫刺激引起的兔動脈血管平滑肌

12、細胞遷移。②降低細胞培養(yǎng)液中MDA含量：兩種濃度辛伐他汀作用48h和72h均顯著抑制兔血管平滑肌細胞中MDA的水平（P<0.01）。作用72h后比48h的抑制作用更大，且兩組辛伐他汀組間有顯著差異（P<0.05）；③抑制核因子-κB表達：正常對照組中核因子-κB表達較低；培養(yǎng)基中加入過氧化氫時，兔血管平滑肌細胞中核因子-κB表達顯著增加（P<0.01），辛伐他汀可抑制這一表達，且高濃度組較低濃度組抑制作用更顯著(P<0.05)。④對血管

13、黏附蛋白-1的作用：免疫組化結果顯示，血管黏附蛋白-1在四組中均輕度著色，無明顯陽性結果，四組相比未見差異。
　　結論：
　　1、血管黏附蛋白-1、核因子-κB在動脈硬化斑塊中有大量表達，且血管粘附蛋白－1與核因子-κB的表達呈明顯正相關；
　　2、一定濃度的過氧化氫可誘導兔血管平滑肌細胞的增殖，且能使細胞培養(yǎng)液中MDA水平升高；
　　3、一定濃度的辛伐他汀可抑制過氧化氫誘導的兔血管平滑肌細胞增殖及遷移，并抑制核