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文檔簡介
1、白癜風是常見慢性皮膚及黏膜色素脫失性疾病,患者約占世界人口的0.5-1%,約50%的患者在20歲前發(fā)病。皮膚白斑雖然無自覺不適,但嚴重危害患者的心理健康,尤其是青少年和青年,造成患者自卑、孤僻等。
白癜風的發(fā)病機制尚未得以充分闡明?;谧陨砻庖邔W說,臨床上外用糖皮質激素、免疫調節(jié)劑,以及NB-UVB照射等治療白癜風,可獲一定的治療效果。但是這些治療手段對于預防白癜風的復發(fā)以及對進展期白癜風的治療明顯不足。一般認為自身免疫只是出
2、現在該病黑素細胞損害的效應階段,激活和引發(fā)自身免疫的具體機制仍不明確。近年來,氧化應激學說得到普遍關注,并得到一系列實驗結果的支持??寡趸瘎┲委煱遵帮L也在臨床上進行了一些嘗試。線粒體是細胞內 ROS產生的主要部位,正常情況下其具有完善的抗氧化體系,當線粒體功能障礙時出現細胞內ROS堆積,導致線粒體損傷。研究發(fā)現,白癜風患者皮損處(角質形成細胞)和皮損周(黑素細胞及角質形成細胞)細胞線粒體超微結構損害,進一步支持氧化應激致病學說。
3、 黃芩素(Baicalein,BE)是從植物黃芩的根中提取的黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗細菌等作用。我們課題組前期研究證實,BE通過抑制p38MAPK通路對抗正常人黑素細胞系(PIG1)氧化應激損傷,另外BE減少CytC釋放,通過抑制線粒體凋亡途徑保護PIG1細胞,但是具體機制尚不明確。核因子E2相關轉錄因子2(Nrf2)是細胞內重要的抗氧化轉錄因子,上調Nrf2可以提高黑素細胞抗氧化應激的能力,誘導HO-1是Nrf2的
4、作用機制之一。在白癜風患者黑素細胞系(PIG3V)中BE是否具有提高細胞抵抗氧化應激損傷能力,改善線粒體功能障礙的作用?其發(fā)揮作用的具體機制又是什么?Nrf2提高黑素細胞抗氧化能力是否存在其他機制?為了解決以上問題,我們提出了如下假說:BE通過激活Nrf2-NRF1-TFAM通路,發(fā)揮改善線粒體功能障礙、促進線粒體生物合成,從而增強黑素細胞抗氧應激損傷能力。本研究以PIG3V細胞為研究對象,在細胞水平觀察BE改善線粒體功能障礙、促進線粒
5、體生物合成和增強細胞抗氧化能力的作用并對其機制進行初步探究,為闡明BE的抗氧化機制提供新思路,為其用于白癜風的臨床治療奠定理論基礎。
研究內容:
1.BE對氧化應激下PIG3V細胞形態(tài)、存活率以及線粒體超微結構、功能和生物合成的影響;
2.BE對于Nrf2以及線粒體合成相關基因的影響;
3.過表達Nrf2對線粒體生物合成及功能的影響。
研究方案:
1.建立PIG3V細胞氧化應激
6、模型,觀察BE預處理的保護作用。實驗分組及處理條件:對照組:黑素細胞培養(yǎng)基;BE組:40μM/L BE處理1h,其后換用黑素細胞培養(yǎng)基處理;H2O2組,0.75mM/L H2O2處理;BE+H2O2組;40μM/L BE處理1h,其后換用0.75mM/L H2O2處理。顯微鏡下觀察BE對PIG3V細胞的保護作用;CCK-8法檢測細胞存活率;電鏡觀察線粒體超微結構變化;MTT法檢測線粒體活性;ENLITEN?ATP檢測試劑盒檢測ATP水平
7、;流式細胞術檢測線粒體膜電位和細胞內ROS;Real-time PCR(RT-PCR)檢測線粒體DNA(mtDNA)拷貝數。
2.蛋白免疫印跡檢測BE對PIG3V細胞Nrf2及線粒體合成相關蛋白(NRF1、TFAM)的影響;
3.采用Nrf2過表達質粒瞬時轉染PIG3V細胞,建立Nrf2過表達模型,觀察過表達Nrf2對線粒體生物合成和功能的影響。熒光顯微鏡觀察和蛋白免疫印跡確認過表達模型是否構建成功;ENLITEN?
8、ATP檢測試劑盒檢測ATP產量;流式細胞術檢測MMP;RT-PCR、蛋白免疫印跡檢測線粒體合成相關基因的mRNA和蛋白水平;RT-PCR檢測mtDNA拷貝數。
結果:
1.形態(tài)學觀察、細胞存活率檢測顯示BE保護氧化應激下PIG3V細胞,提高其抵抗氧化應激損傷的能力;
2.BE減輕氧化應激下PIG3V細胞線粒體超微結構的損害;
3.BE改善氧化應激下PIG3V細胞線粒體功能障礙:增強線粒體活性、提高
9、MMP、促進ATP生成、降低細胞內ROS水平;
4.BE促進氧化應激下PIG3V細胞線粒體生物合成;
5.BE上調Nrf2通路,促進PIG3V細胞線粒體生物合成相關蛋白(NRF1、TFAM)表達;
6.過表達Nrf2改善線粒體功能:提高線粒體膜電位、促進ATP生成;
7.過表達Nrf2促進線粒體合成:線粒體生物合成相關(NRF1、TFAM)mRNA、蛋白水平升高;mtDNA拷貝數增加。
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