紫杉烷化合物的抗氧化應(yīng)激作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:神經(jīng)保護(hù)藥物是治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要治療方法,具有極為廣闊的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用空間,現(xiàn)已證明證明鈣拮抗劑尼莫地平對(duì)于急性缺血性腦血管病的死亡率無(wú)明顯改善。替拉扎特治療組卒中的隨機(jī)對(duì)照的臨床試驗(yàn)由于缺乏效果已被提前停止。氧自由基清除劑依達(dá)拉奉尚沒(méi)有足夠的臨床試驗(yàn)證明其神經(jīng)保護(hù)作用,目前人類已將眾多中藥應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床研究,目前尚缺乏證據(jù)證明其臨床有效性,人類仍在積極地致力于神經(jīng)保護(hù)藥物的開(kāi)發(fā)與研究,在自然界中尋找具有神經(jīng)保護(hù)作用的化

2、合物是開(kāi)發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)作用藥物的重要方法,萜類化合物是一大類植物次生產(chǎn)物的總稱,研究顯示萜類化合物具有神經(jīng)保護(hù)作用,如樟芝(樟菇,最貴的蘑菇)中提取的五種二萜類化合物,在在體研究中適當(dāng)濃度時(shí)表現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)作用。紫杉醇是最初自紅豆杉樹(shù)皮中提取的一類復(fù)雜的二萜類化合物,具有含氧四環(huán)的紫杉烷環(huán)及酯側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。人們對(duì)其抗腫瘤作用及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了深入、廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)有些化合物與抗腫瘤作用并無(wú)關(guān)聯(lián),本實(shí)驗(yàn)從具有某些結(jié)構(gòu)特征的紫杉烷化合物中篩選具有

3、抗氧化應(yīng)激作用研究的化合物并對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究。
　　 實(shí)驗(yàn)一氧化應(yīng)激模型的建立
　　 目的:應(yīng)用H2O2處理SK-N-SH細(xì)胞建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。
　　 方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SK-N-SH細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,分4組接種于96孔培養(yǎng)板,每組三個(gè)復(fù)孔,每孔100μL,37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng),12小時(shí)后,加入100μL不同濃度H2O2,使各組H2O2終濃度分別為0、50、100、150μ

4、mol/L,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),采用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞活力。
　　 結(jié)論:H2O2對(duì)SK-N-SH細(xì)胞具有損傷作用,在50-150μmol/L范圍內(nèi)呈濃度依賴關(guān)系,150μmol/L H2O2處理24h后細(xì)胞活力為26.1±1.1％,因此將此濃度作為建立細(xì)胞模型濃度。
　　 實(shí)驗(yàn)二篩選具有抗氧化應(yīng)激活性的紫杉烷化合物
　　 目的:篩選具有抗氧化應(yīng)激作用的紫杉烷類化合物,并分析其構(gòu)效關(guān)系。
　　

5、方法:實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、處理組、陽(yáng)性對(duì)照組、正常對(duì)照組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Sk-N-Sh細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL,分別接種于96孔培養(yǎng)板,每孔160μL,37℃、5％CO2飽和濕度下培養(yǎng),12小時(shí)后,各組細(xì)胞加入不同試劑?？瞻讓?duì)照組:每孔加入40μL PBS;陰性對(duì)照組:每孔加入20μL1640培養(yǎng)基,2小時(shí)后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L;處理組:包括Taxine

6、 B、7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A每種藥物三個(gè)濃度組,共12個(gè)亞組,每亞組三復(fù)孔。每孔加入20μL不同種類、濃度的化合物,2小時(shí)后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L,藥物終濃度為1、10和100μmol/L;陽(yáng)性對(duì)照組:每孔加入20μL表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epig

7、allocatechin Gallatte,E G C G)(100μmol/L),2小時(shí)后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L,EGCG終濃度為10μmol/L;正常對(duì)照組分別加入20μL PBS和20μL濃度為1mmol/L的7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、Taxine B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine

8、使四種紫杉烷化合物終濃度均為100μmol/L,共4個(gè)亞組。各組細(xì)胞處理24小時(shí)后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,HO熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)選用的四種化合物Taxine B、7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A均為自紫杉中提取的紫杉烷類化合物,擁有共同的母環(huán)結(jié)構(gòu),具有共同的特點(diǎn)本試驗(yàn)化合物C13位乙酰基取

9、代長(zhǎng)側(cè)鏈,C1位羥基消失,C2位乙?；媪吮郊柞；?C4位乙酰基消失,C5位的羥基導(dǎo)致氧丁環(huán)消失。他們的區(qū)別在于:Taxine B在C5位上含有羥基,C7位上含有乙酰基;7-Deacetyl-taxine B C5、C7位上含有羥基;5-Cinnamoyloxy-taxin B在C7位上含有乙酰基,C5位上含有脂溶性側(cè)鏈;7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A在C7位上含有乙酰基,C5位含有堿性性長(zhǎng)鏈基團(tuán)。<

10、br>　　 結(jié)果表明經(jīng)修飾后的紫杉烷并未表現(xiàn)抗腫瘤作用,可能與他們共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān):C13位取代側(cè)鏈,C1位取代了羥基,C2位代之以乙?；?C4位乙酰基消失,C5位代之以羥基導(dǎo)致氧丁環(huán)消失。
　　 7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B化合物不僅細(xì)胞毒性消失,并且使氧化應(yīng)激細(xì)胞模型細(xì)胞活力顯著提高,表現(xiàn)了抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)保護(hù)作用。其中7-Deacetyl-taxine B抗氧化應(yīng)

11、激作用強(qiáng)于5-Cinnamoyloxy-taxin B,Taxine B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A較對(duì)陰性對(duì)照比較無(wú)顯著性差異。7-Deacetyl-taxine B的抗氧化應(yīng)激作用最強(qiáng),可能由于此化合物5、7位上相鄰羥基的穩(wěn)定苯氧自由基結(jié)構(gòu)的作用導(dǎo)致了抗氧化應(yīng)激作用的增強(qiáng)。
　　 本實(shí)驗(yàn)SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)H2O2處理24h后,Hoechst染色顯示陰性組顯示大量細(xì)胞染色質(zhì)凝聚;100μ

12、mol/L7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B、10μLmol/L EGCG處理后染色質(zhì)凝聚細(xì)胞較陰性對(duì)照組明顯較少,Taxine B、7,10-Diacetyl-2'-deoxyl-taxine A處理后減少不明顯?；衔锏目寡趸瘧?yīng)激作用可能與阻止細(xì)胞質(zhì)凝集,減少細(xì)胞染色質(zhì)損傷有關(guān)。
　　 實(shí)驗(yàn)三、紫杉烷化合物對(duì)于H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷保護(hù)的機(jī)制研究
　　 目的:探討紫

13、杉烷類化合物抗氧化應(yīng)激神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組和處理組,每組包含3個(gè)復(fù)孔,每孔加入160μL細(xì)胞濃度為1×105/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,細(xì)胞在37℃、5％CO2,飽和濕度下培養(yǎng),12小時(shí)后給予藥物干預(yù)。
　　 對(duì)照組:每孔加入20μL1640培養(yǎng)基,2小時(shí)后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L。
　　 處理組:包括7-Deacetyl-ta

14、xine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B兩組,每組三復(fù)孔。每孔加入20μL不同種類的化合物,2小時(shí)后加入20μL H2O2(1.5mmol/L),使H2O2終濃度為150μmol/L,藥物終濃度為100μmol/L。各組細(xì)胞處理24小時(shí)后,透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變,流式細(xì)胞術(shù)觀察其細(xì)胞凋亡率的變化、細(xì)胞內(nèi)氧自由基的含量和細(xì)胞線粒體膜電位的變化。
　　 結(jié)論:
　　 1、H2O2可使SK-N-SH細(xì)胞的

15、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,染色質(zhì)固縮、濃染、邊集,細(xì)胞小體形成,H2O2的氧化應(yīng)激損傷與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 2、應(yīng)用紫杉烷類化合物7-Deacetyl-taxine B、5-Cinnamoyloxy-taxin B化合物處理氧化應(yīng)激細(xì)胞模型可使細(xì)胞凋亡率明顯減少,存活率提高,線粒體腫脹減輕,線粒體膜電位明顯提高,說(shuō)明紫杉烷化合物的抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)保護(hù)作用可能與保護(hù)線粒體、減少凋亡有關(guān)。
　　 3、應(yīng)用紫杉烷類化合物7-D