查爾酮類化合物的抗氧化活性及其初步機制研究.pdf

1、目的:將一系列合成的新型查爾酮類化合物，通過1，1-二苯基-2-三硝基苦肼(1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)實驗和對過氧化氫(H2O2)誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)損傷的抗氧化活性的篩選實驗，選出活性較好的化合物，研究其對細胞Nrf2/ARE抗氧化信號通路的影響和對H2O2誘導細胞損傷的保護機制。
　　方法:選擇本課題組在前期設計合成的三類查爾酮類化合物:查爾酮（

2、L類）、螺雜環(huán)類查爾酮（D類）和?；闋柾╔類），用DPPH清除率實驗檢測其對自由基的清除活性;建立H2O2誘導PC12細胞損傷模型，用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法篩選化合物的抗氧化活性及檢測活性化合物的細胞毒性;選擇活性化合物，用real-time PCR法檢測化合物對NF-E2相關因子2(Nrf2)的調(diào)控基因谷氨酰半胱氨酸連接酶亞基(GCLC)、血紅素加氧酶1(HO-1)mRNA表達的影響

3、;用Western blot法檢測化合物對Nrf2調(diào)控基因HO-1、GCLC的轉(zhuǎn)錄蛋白的作用;用Hoechst染色檢測其對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的保護作用;用MTT法檢測不同濃度的化合物對H2O2誘導的細胞生存率的作用以及HO-1的抑制劑與GCLC的抑制劑對H2O2損傷的細胞生存率的影響。
　　結果:1、苯環(huán)具有3，4-OH取代的查爾酮類化合物對DPPH有較高的自由基清除活性。
　　2、化合物對H2O2誘導的細胞損傷

4、保護作用的篩選實驗中，三類化合物在10μmol/L（μM）濃度下提前給藥1小時(h)或24h，再經(jīng)H2O2損傷后，細胞的生存率都出現(xiàn)不同的變化:L類化合物孵育1h時，苯環(huán)上有鄰二羥基的化合物能明顯提高細胞的生存率;孵育24h，苯環(huán)的b環(huán)上有鄰二羥基的化合物能提高細胞的生存率，而a環(huán)上有鄰二羥基的普遍沒有提高細胞生存率的作用。
　　D類化合物孵育1h時，苯環(huán)上有鄰二羥基的化合物能提高細胞的生存率;孵育24h，有鄰二羥基的同樣具有很好

5、的活性，一部分無鄰二羥基的化合物也具有很好的活性。X類化合物孵育1h時，并不能提高細胞的生存率;但孵育24h后，化合物普遍對細胞表現(xiàn)出了較好的保護作用。
　　3、所有的活性化合物在濃度為10μM時對細胞都無毒性。
　　4、直接中和自由基的抗氧化作用機制:L4123作為L類化合物中a環(huán)有鄰二羥基的代表化合物，能濃度依賴性地提高經(jīng)H2O2誘導損傷的細胞的生存率，并降低細胞內(nèi)MDA的水平，同時L4123也能降低凋亡蛋白cleave

6、d Caspase-3的表達，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而減少凋亡細胞的數(shù)量。
　　5、激活Nrf2/ARE抗氧化信號通路的作用機制:L0217和L0224，LD19231和LF04042，603和X60314分別是L類、D類和X類查爾酮的代表化合物，我們檢測了其對Nrf2/ARE通路的激活能力。由實驗可得，這六個化合物均能顯著上調(diào)Nrf2調(diào)控基因的下游基因HO-1和GCLC的mRNA的水平及轉(zhuǎn)錄蛋白的水平，減少了H2O2

7、誘導的細胞的凋亡，提高了細胞的生存率，并且在使用HO-1的抑制劑和GCLC的抑制劑后，化合物對H2O2損傷的細胞保護作用明顯降低。
　　6、L0224在脂多糖(LPS)誘導的小鼠小膠質(zhì)細胞(BV2)的炎癥模型中，能降低細胞NO的水平和炎癥因子誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的水平。
　　結論:1、查爾酮類化合物中的苯環(huán)具有鄰二羥基取代的化合物有直接清除自由基的作用，因而能保護細胞抵御H2O2的氧化損傷。
　　2、苯環(huán)上的

8、b環(huán)具有鄰二羥基取代的化合物除了有直接清除自由基的作用外，還能激活細胞的Nrf2/ARE抗氧化信號通路，顯示了這類化合物對細胞的雙重保護機制，預期將會有更好的應用前景。
　　3、苯環(huán)上沒有鄰二羥基取代的部分化合物也有激活細胞的Nrf2/ARE抗氧化信號通路的作用。新型螺雜環(huán)類查爾酮中的LF04042和大部分的酰基化查爾酮都沒有鄰二羥基，不能中和自由基，卻都能激活細胞的抗氧化信號通路，都有較好的抗氧化作用。這顯示了螺雜環(huán)類查爾酮作為