應(yīng)激及炎癥因素在干眼發(fā)病中的作用.pdf

1、干眼是一類受到多種因素影響的疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前受到較廣泛認(rèn)可的是眼表一淚液分泌神經(jīng)反饋環(huán)路的干眼發(fā)病學(xué)說(shuō)。眼表上皮細(xì)胞作為眼表面的首道屏障，是維持眼表正常的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，也是干眼發(fā)病中的主要效應(yīng)組織，其改變?cè)诓煌愋透裳壑芯哂休^高相似性。關(guān)于機(jī)體的應(yīng)激及免疫炎癥因素在干眼發(fā)病中的具體作用及其引起的眼表.淚腺功能單位的改變尚需要進(jìn)一步深入研究。
　　 本課題就上述問(wèn)題進(jìn)行了以下研究：
　　 第1章：水液缺乏性千眼患者角膜

2、上皮層內(nèi)炎癥細(xì)胞的分布及密度研究
　　 目的：探討水液缺乏性干眼患者角膜上皮層內(nèi)炎癥細(xì)胞的形態(tài)、分布、密度及其與淚液功能異常問(wèn)的相關(guān)性。
　　 方法：選擇46例(46眼)水液缺乏性干眼患者，其中32例(32眼)為非Sjogren's綜合征患者(NSS)，其余14例(14眼)為Sjogren's綜合征患者(SS)，另外取33人(33眼)作為正常對(duì)照。應(yīng)用激光共焦角膜顯微鏡(HRT-IIICM)觀察中央部及周邊部角膜上皮層內(nèi)

3、Langerhans細(xì)胞(LC)以及白細(xì)胞的分布、形態(tài)及密度，同時(shí)對(duì)這些受試者進(jìn)行淚膜破裂時(shí)間(TFBUT)、淚液分泌(Schirmer I試驗(yàn))、熒光素角膜染色觀察，通過(guò)多因素回歸分析探討角膜上皮層內(nèi)炎癥細(xì)胞分布特點(diǎn)與干眼臨床特點(diǎn)之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：正常對(duì)照者中央?yún)^(qū)及周邊部角膜上皮層內(nèi)存在一定數(shù)量LC，其密度分別為34.9±5.7 cells/mm2及90.7±8.2 cells/mm2；而水液缺乏性干眼患者角膜上皮層

4、內(nèi)的LC密度均明顯增高，以中央角膜上皮層內(nèi)最為顯著。其中，NSS患者中央?yún)^(qū)角膜上皮層內(nèi)LC數(shù)量為89.8±10.8 cells/mm2，而SS患者為127.9±23.7cells/mm2。此外，LC細(xì)胞的形態(tài)與正常對(duì)照相比較，水液缺乏性干眼患者的LC中具有多個(gè)突起以及長(zhǎng)突起的LC比例明顯增高。正常對(duì)照組角膜上皮層內(nèi)白細(xì)胞數(shù)目很少，而水液缺乏性干眼患者角膜上皮內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量明顯增高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，角膜上皮層內(nèi)LC以及白細(xì)胞這兩種炎癥細(xì)胞密

5、度與干眼臨床檢查所示的干眼炎癥程度呈明顯正相關(guān)。
　　 結(jié)論：水液缺乏性干眼患者角膜上皮層內(nèi)LC以及白細(xì)胞的改變提示其可能參與干眼發(fā)病。激光共焦角膜顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察中央角膜上皮細(xì)胞層內(nèi)炎癥細(xì)胞的分布、密度可以用于輔助監(jiān)測(cè)干眼嚴(yán)重程度并幫助指導(dǎo)治療。
　　 第2章：液氣界面法培養(yǎng)人結(jié)膜組織塊建立的體外模型
　　 目的：探討液氣界面法培養(yǎng)人結(jié)膜組織塊所建立的體外模型的病理學(xué)特征。
　　 方法：將球結(jié)膜組織塊分別

6、用液氣界面培養(yǎng)法及培養(yǎng)基浸沒(méi)法培養(yǎng)2周。進(jìn)行HE染色，應(yīng)用p63，Pax6，K16，K19和K10染色判斷結(jié)膜上皮的增殖和分化情況，應(yīng)用MUC5AC，MUC19，MUC4和MUC16染色判斷粘蛋白的改變和杯狀細(xì)胞的變化，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)結(jié)膜組織塊內(nèi)的凋亡細(xì)胞，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)體系中的炎癥因子MMP9，TNF-α和IL-1β濃度變化。
　　 結(jié)果：液氣界面法(AL組)培養(yǎng)1周以上的人球結(jié)膜組織塊具有多項(xiàng)干眼類似的病理學(xué)

7、特征。干燥應(yīng)激后結(jié)膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯復(fù)層化增加，而這一現(xiàn)象不出現(xiàn)在培養(yǎng)基浸沒(méi)組(SUB組)。AL組結(jié)膜上皮的K19表達(dá)下調(diào)，表層上皮細(xì)胞出現(xiàn)K10陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明其出現(xiàn)向角化上皮的異常分化。同時(shí)，Pax6的核內(nèi)染色在液氣界面培養(yǎng)2天開始即出現(xiàn)明顯下降，表現(xiàn)為核周染色或胞漿染色。組織塊體外培養(yǎng)4天起結(jié)膜上皮的MUC5AC表達(dá)明顯減弱，10天后完全消失。AL組MUC19的成膠型粘蛋白形式的表達(dá)從培養(yǎng)后2天即消失，而膜結(jié)合型形式的表達(dá)也隨培養(yǎng)時(shí)

8、間延長(zhǎng)逐漸減弱。兩組MUC4和MUC16染色均失去了正常對(duì)照組的全層表達(dá)的形式。AL組培養(yǎng)2天起結(jié)膜上皮以及基質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，且培養(yǎng)10天后明顯增多。AL組條件培養(yǎng)基內(nèi)炎癥介質(zhì)MMP-9，TNF-α和IL-1β濃度在培養(yǎng)1周左右明顯增高。
　　 結(jié)論：空氣暴露的干燥應(yīng)激可以使體外培養(yǎng)的人球結(jié)膜組織出現(xiàn)杯狀細(xì)胞減少或消失、鱗狀上皮化生、細(xì)胞凋亡、粘蛋白改變、炎癥介質(zhì)濃度增高等改變，與臨床干眼具有類似性。這一干燥應(yīng)激的體外模

9、型可以對(duì)干眼發(fā)病機(jī)制、干眼藥物篩選等研究提供幫助。
　　 第3章：液氣界面法培養(yǎng)人結(jié)膜組織塊模型中信號(hào)傳導(dǎo)通路研究
　　 目的：探討空氣暴露法培養(yǎng)人結(jié)膜組織塊模型中p38MAPK信號(hào)通路以及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活情況。
　　 方法：將球結(jié)膜組織塊分為4組培養(yǎng)2周，除液氣界面法(AL)及培養(yǎng)基浸沒(méi)法(SUB)兩組外，p38MAPK通路抑制組為AL聯(lián)合培養(yǎng)體系內(nèi)加入p38MAPK抑制劑SB203580(SB組)，而

10、Wnt通路抑制組為AL聯(lián)合培養(yǎng)體系內(nèi)加入Wnt抑制劑DKK1。進(jìn)行HE染色，應(yīng)用磷酸化p38MAPK染色判斷p38MAPK通路的激活情況，應(yīng)用β-catenin及磷酸化β-catenin染色判斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活情況，應(yīng)用K10染色判斷結(jié)膜上皮的分化方向。
　　 結(jié)果：磷酸化p38MAPK染色顯示空氣暴露引起的干燥應(yīng)激早期即出現(xiàn)結(jié)膜上皮細(xì)胞的陽(yáng)性核內(nèi)染色，并逐漸出現(xiàn)結(jié)膜基質(zhì)細(xì)胞的核內(nèi)染色，而SUB組染色強(qiáng)度明顯弱于AL組，

11、且其核染出現(xiàn)時(shí)間較晚。培養(yǎng)體系內(nèi)加入SB203580后未見結(jié)膜組織內(nèi)p-p38MAPK的陽(yáng)性核染，也可以抑制結(jié)膜上皮細(xì)胞的異常分化，K10染色陰性。AL組培養(yǎng)2-6大可以檢測(cè)到β-catenin及磷酸化β-catenin的表達(dá)增高，出現(xiàn)胞漿內(nèi)聚積以及核內(nèi)染色，提示W(wǎng)nt信號(hào)傳導(dǎo)通路在AL組的短期激活。培養(yǎng)體系內(nèi)加入DKK1后，干燥應(yīng)激培養(yǎng)的結(jié)膜組織塊上皮層數(shù)減少，β-catenin染色類似于正常結(jié)膜一僅位于細(xì)胞膜表面，而K10染色陰性。