應激及炎癥因素在干眼發(fā)病中的作用.pdf

1、干眼是一類受到多種因素影響的疾病，發(fā)病機制復雜，目前受到較廣泛認可的是眼表一淚液分泌神經(jīng)反饋環(huán)路的干眼發(fā)病學說。眼表上皮細胞作為眼表面的首道屏障，是維持眼表正常的關鍵結構，也是干眼發(fā)病中的主要效應組織，其改變在不同類型干眼中具有較高相似性。關于機體的應激及免疫炎癥因素在干眼發(fā)病中的具體作用及其引起的眼表.淚腺功能單位的改變尚需要進一步深入研究。
　　 本課題就上述問題進行了以下研究：
　　 第1章：水液缺乏性千眼患者角膜

2、上皮層內炎癥細胞的分布及密度研究
　　 目的：探討水液缺乏性干眼患者角膜上皮層內炎癥細胞的形態(tài)、分布、密度及其與淚液功能異常問的相關性。
　　 方法：選擇46例(46眼)水液缺乏性干眼患者，其中32例(32眼)為非Sjogren's綜合征患者(NSS)，其余14例(14眼)為Sjogren's綜合征患者(SS)，另外取33人(33眼)作為正常對照。應用激光共焦角膜顯微鏡(HRT-IIICM)觀察中央部及周邊部角膜上皮層內

3、Langerhans細胞(LC)以及白細胞的分布、形態(tài)及密度，同時對這些受試者進行淚膜破裂時間(TFBUT)、淚液分泌(Schirmer I試驗)、熒光素角膜染色觀察，通過多因素回歸分析探討角膜上皮層內炎癥細胞分布特點與干眼臨床特點之間的相關性。
　　 結果：正常對照者中央?yún)^(qū)及周邊部角膜上皮層內存在一定數(shù)量LC，其密度分別為34.9±5.7 cells/mm2及90.7±8.2 cells/mm2；而水液缺乏性干眼患者角膜上皮層

4、內的LC密度均明顯增高，以中央角膜上皮層內最為顯著。其中，NSS患者中央?yún)^(qū)角膜上皮層內LC數(shù)量為89.8±10.8 cells/mm2，而SS患者為127.9±23.7cells/mm2。此外，LC細胞的形態(tài)與正常對照相比較，水液缺乏性干眼患者的LC中具有多個突起以及長突起的LC比例明顯增高。正常對照組角膜上皮層內白細胞數(shù)目很少，而水液缺乏性干眼患者角膜上皮內白細胞數(shù)量明顯增高。統(tǒng)計學分析顯示，角膜上皮層內LC以及白細胞這兩種炎癥細胞密

5、度與干眼臨床檢查所示的干眼炎癥程度呈明顯正相關。
　　 結論：水液缺乏性干眼患者角膜上皮層內LC以及白細胞的改變提示其可能參與干眼發(fā)病。激光共焦角膜顯微鏡動態(tài)觀察中央角膜上皮細胞層內炎癥細胞的分布、密度可以用于輔助監(jiān)測干眼嚴重程度并幫助指導治療。
　　 第2章：液氣界面法培養(yǎng)人結膜組織塊建立的體外模型
　　 目的：探討液氣界面法培養(yǎng)人結膜組織塊所建立的體外模型的病理學特征。
　　 方法：將球結膜組織塊分別

6、用液氣界面培養(yǎng)法及培養(yǎng)基浸沒法培養(yǎng)2周。進行HE染色，應用p63，Pax6，K16，K19和K10染色判斷結膜上皮的增殖和分化情況，應用MUC5AC，MUC19，MUC4和MUC16染色判斷粘蛋白的改變和杯狀細胞的變化，應用TUNEL法檢測結膜組織塊內的凋亡細胞，應用ELISA法檢測培養(yǎng)體系中的炎癥因子MMP9，TNF-α和IL-1β濃度變化。
　　 結果：液氣界面法(AL組)培養(yǎng)1周以上的人球結膜組織塊具有多項干眼類似的病理學

7、特征。干燥應激后結膜上皮細胞出現(xiàn)明顯復層化增加，而這一現(xiàn)象不出現(xiàn)在培養(yǎng)基浸沒組(SUB組)。AL組結膜上皮的K19表達下調，表層上皮細胞出現(xiàn)K10陽性表達，說明其出現(xiàn)向角化上皮的異常分化。同時，Pax6的核內染色在液氣界面培養(yǎng)2天開始即出現(xiàn)明顯下降，表現(xiàn)為核周染色或胞漿染色。組織塊體外培養(yǎng)4天起結膜上皮的MUC5AC表達明顯減弱，10天后完全消失。AL組MUC19的成膠型粘蛋白形式的表達從培養(yǎng)后2天即消失，而膜結合型形式的表達也隨培養(yǎng)時

8、間延長逐漸減弱。兩組MUC4和MUC16染色均失去了正常對照組的全層表達的形式。AL組培養(yǎng)2天起結膜上皮以及基質細胞出現(xiàn)凋亡陽性細胞，且培養(yǎng)10天后明顯增多。AL組條件培養(yǎng)基內炎癥介質MMP-9，TNF-α和IL-1β濃度在培養(yǎng)1周左右明顯增高。
　　 結論：空氣暴露的干燥應激可以使體外培養(yǎng)的人球結膜組織出現(xiàn)杯狀細胞減少或消失、鱗狀上皮化生、細胞凋亡、粘蛋白改變、炎癥介質濃度增高等改變，與臨床干眼具有類似性。這一干燥應激的體外模

9、型可以對干眼發(fā)病機制、干眼藥物篩選等研究提供幫助。
　　 第3章：液氣界面法培養(yǎng)人結膜組織塊模型中信號傳導通路研究
　　 目的：探討空氣暴露法培養(yǎng)人結膜組織塊模型中p38MAPK信號通路以及Wnt信號傳導通路的激活情況。
　　 方法：將球結膜組織塊分為4組培養(yǎng)2周，除液氣界面法(AL)及培養(yǎng)基浸沒法(SUB)兩組外，p38MAPK通路抑制組為AL聯(lián)合培養(yǎng)體系內加入p38MAPK抑制劑SB203580(SB組)，而

10、Wnt通路抑制組為AL聯(lián)合培養(yǎng)體系內加入Wnt抑制劑DKK1。進行HE染色，應用磷酸化p38MAPK染色判斷p38MAPK通路的激活情況，應用β-catenin及磷酸化β-catenin染色判斷Wnt信號傳導通路的激活情況，應用K10染色判斷結膜上皮的分化方向。
　　 結果：磷酸化p38MAPK染色顯示空氣暴露引起的干燥應激早期即出現(xiàn)結膜上皮細胞的陽性核內染色，并逐漸出現(xiàn)結膜基質細胞的核內染色，而SUB組染色強度明顯弱于AL組，

11、且其核染出現(xiàn)時間較晚。培養(yǎng)體系內加入SB203580后未見結膜組織內p-p38MAPK的陽性核染，也可以抑制結膜上皮細胞的異常分化，K10染色陰性。AL組培養(yǎng)2-6大可以檢測到β-catenin及磷酸化β-catenin的表達增高，出現(xiàn)胞漿內聚積以及核內染色，提示W(wǎng)nt信號傳導通路在AL組的短期激活。培養(yǎng)體系內加入DKK1后，干燥應激培養(yǎng)的結膜組織塊上皮層數(shù)減少，β-catenin染色類似于正常結膜一僅位于細胞膜表面，而K10染色陰性。