腸道菌群及腸道炎癥在OLETF大鼠糖尿病發(fā)病中的動態(tài)變化.pdf

1、目的：
　　近些年越來越多的研究顯示，2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展與腸道細菌的變化密切相關(guān)，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變通過誘導(dǎo)腸壁炎癥反應(yīng)，損傷腸粘膜屏障完整性，進而造成體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)，參與胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的整個過程。本研究通過分析自發(fā)性2型糖尿病大鼠——OLETF大鼠從正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量下降階段至糖尿病階段的整個發(fā)病過程中腸道菌群結(jié)構(gòu)、腸道及血清細菌脂多糖水平、腸道炎癥反應(yīng)、腸道組織病理以及腸粘膜滲

2、漏性的動態(tài)變化，以探討腸道菌群紊亂在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在機制。
　　方法：
　　選取自發(fā)2型糖尿病大鼠OLETF大鼠作為模型組大鼠，觀察其病程進展的不同階段（正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量下降階段、糖尿病階段），同時選取與OLETF大鼠相同遺傳背景的LETO大鼠作為正常對照組大鼠，對各組及不同病程階段的大鼠留取血標本及糞便標本，同時處死對應(yīng)時期的相應(yīng)數(shù)量的大鼠取腸道組織標本。生化法檢測大鼠基本生

3、化指標；運用16S rDNA焦磷酸測序技術(shù)進行腸道菌群基因測序，以鑒別菌群的多樣性以及在不同分類水平上的豐度；ELISA法檢測血清及糞便脂多糖（LPS）水平，同時運用該方法檢測血清中的腸道滲漏指標連蛋白（zonulin）、二胺氧化酶（DAO）；通過光鏡對腸粘膜上皮絨毛、完整性等病理改變進行觀察，通過透射電鏡對腸粘膜上皮緊密連接、中間連接及橋粒連接等細微結(jié)構(gòu)的改變進行觀察；運用Western blot技術(shù)對腸道組織局部炎癥指標TLR4及N

4、Fκb進行檢測；分析以上各個指標在正常對照組（NC組）、OLETF大鼠正常血糖階段（NGT組）、正常血糖-高胰島素血癥階段（HI組）、糖耐量減低階段（IGT組）及糖尿病階段（DM組）的動態(tài)變化。
　　結(jié)果：
　?。?）LETO大鼠（也即正常對照組大鼠）與OLETF大鼠基線資料（也即OLETF大鼠正常血糖階段）相比，細菌門類構(gòu)成上差異不明顯，但在排名前十位的細菌種屬中，OLETF大鼠正常血糖階段的乳酸菌屬及Phascholar

5、ctobacterium菌屬的相對豐度較LETO大鼠明顯偏低（P<0.05）；而血清及糞便LPS水平兩組無明顯差異；腸組織局部炎癥標志物TLR4和NFκB的表達量兩組間無明顯差異；血清中的腸道滲漏標志物zonulin和DAO兩組間也無明顯差異。
　?。?）OLETF大鼠在正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量減低階段、糖尿病階段的腸道微生物豐富度及物種總數(shù)具有明顯差異，正常血糖-高胰島素血癥階段開始，較正常血糖階段腸道微

6、生物的物種總數(shù)就明顯下降，而在正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量降低階段及糖尿病階段的動態(tài)發(fā)病過程中，腸道微生物的物種總數(shù)逐漸升高。說明在OLETF大鼠糖尿病發(fā)生之前，腸道菌群的結(jié)構(gòu)就已經(jīng)發(fā)生變化，并且在糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程中，腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化參與其中；
　　（3）腸道菌群在門水平上的檢測結(jié)果顯示，OLETF大鼠在正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量降低階段及糖尿病階段，各組的菌群豐度排名前三位的細菌門類均為：硬壁菌

7、門，擬桿菌門，變形菌門，但是各組間這三個主要門類的細菌豐度的比例差異較大；
　?。?）我們以擬桿菌門與變形菌門的總和與硬壁菌門的比值作為評價革蘭氏染色陰性細菌與革蘭氏染色陽性細菌的比值，結(jié)果現(xiàn)實：OLETF大鼠正常血糖階段腸道革蘭氏染色陰性的細菌與革蘭氏染色陽性細菌的比例為1.10，而正常血糖-高胰島素血癥階段為2.27、糖耐量降低階段為1.18，糖尿病階段為2.00，均表現(xiàn)為革蘭氏染色陰性細菌的比例增加，而革蘭氏染色陽性細菌比例

8、減少。
　?。?）血清及糞便脂多糖（LPS）水平在OLETF大鼠正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量降低階段、糖尿病階段呈升高趨勢，且血清及糞便LPS水平在OLETF大鼠糖尿病階段較正常血糖階段明顯升高（P<0.05）。
　?。?）腸道組織TLR4及NFκB的表達量在OLETF大鼠正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量減低階段、糖尿病階段呈升高趨勢，正常血糖-高胰島素血癥階段及糖耐量減低階段較正常血糖階

9、段均明顯升高（P<0.05），糖尿病階段較正常血糖階段、高胰島素血癥階段及糖耐量減低階段均明顯升高（P<0.05）。（7）病理觀察顯示，與OLETF大鼠正常血糖階段相比，從正常血糖-高胰島素血階段開始，小腸上皮的完整性開始降低，緊密連接及中間連接開始損傷，至糖尿病階段腸粘膜完整性變化更加明顯。
　　（8）血清zonulin在OLETF大鼠正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量減低階段、糖尿病階段呈逐漸升高的趨勢，且糖尿病

10、階段較正常血糖階段升高較明顯（P<0.05）；而血清DAO水平在四組間也呈升高趨勢，且正常血糖-高胰島素血癥階段及糖尿病階段與正常血糖階段相比升高均比較明顯（P<0.05）。結(jié)論：
　　（1）LETO大鼠與OLETF大鼠基線狀態(tài)下的腸道菌群結(jié)構(gòu)有差異，可能與兩種大鼠遺傳背景存在差異有關(guān)，因此腸道菌群紊亂可能參與OLETF大鼠自然發(fā)病的過程。
　?。?）在OLETF大鼠2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中，腸道菌群存在動態(tài)變化過程。在正常