一氧化氮對(duì)小鼠成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和礦化調(diào)控.pdf

1、牙槽骨、頜骨骨質(zhì)喪失是全身或局部因素長(zhǎng)期作用于口腔頜面部的表現(xiàn)，對(duì)臨床種植牙成功率有重要影響。全身代謝狀況和局部骨組織病理性改變可能導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能受損，破壞骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的聯(lián)系，不利于種植體達(dá)到完善的骨整合以及遠(yuǎn)期穩(wěn)定性。如果能夠通過(guò)藥物和種植體設(shè)計(jì)調(diào)控骨的改建和重建行為，口頜骨缺失患者的牙種植修復(fù)會(huì)得到進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。 由于全身骨量減少和頜骨骨喪失的相關(guān)性，國(guó)外學(xué)者應(yīng)用影響全身骨礦密度的治療方法如激素替代療法

2、、二膦酸鹽等，對(duì)牙槽骨、頜骨丟失也產(chǎn)生了一定效果。不過(guò)，目前臨床上還沒(méi)有治療全身或局部骨丟失的理想藥物或方法。 一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是半衰期極短的一種自由基氣體分子，來(lái)源于L-精氨酸，由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)催化。近年來(lái)人們對(duì)NO在骨代謝以及骨細(xì)胞活性方面的影響做了大量研究，發(fā)現(xiàn)NO是骨形成和骨吸收過(guò)程中極為重要的調(diào)節(jié)因子，但關(guān)于NO在頜骨骨代謝方面作用的研究還很

3、少。 本實(shí)驗(yàn)作為人工種植牙給藥系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)研究的一部分，通過(guò)比較NO供體S亞硝基N乙?；嗝拱?S-nitroso-N-acetyl-dl-penicillamine，SNAP)、L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)以及NOS抑制劑NG-亞硝基L精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine-methyl-ester，L-NAME)對(duì)小鼠原代分離培養(yǎng)的牙槽骨成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1的增殖、分化及礦化

4、的作用，以及對(duì)藥物導(dǎo)致的快速骨質(zhì)喪失小鼠模型頜骨骨礦化的影響，探討NO在頜骨成骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化中可能的途徑和機(jī)制，為進(jìn)一步研究頜骨骨代謝提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床人工種植牙全身或局部給藥提高骨質(zhì)缺失頜骨之牙種植成功率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究共分三個(gè)部分： 第一部分： 目的：分離培養(yǎng)和鑒定小鼠牙槽骨來(lái)源的成骨細(xì)胞。方法：采用酶消化法和植塊法相結(jié)合，分離培養(yǎng)并觀察成骨細(xì)胞形態(tài)，測(cè)定原代成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞分裂曲線。用堿性磷酸

5、酶染色和Von Kossa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成骨細(xì)胞礦化的表現(xiàn)型。結(jié)果：酶消化法和植塊法相結(jié)合可增加細(xì)胞成活率，提高培養(yǎng)效率，獲得了較高純度和數(shù)量的成骨細(xì)胞。成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色可見(jiàn)成骨細(xì)胞胞漿陽(yáng)性紅色無(wú)定形沉淀，Von Kossa染色見(jiàn)細(xì)胞聚集處有棕黑色顆粒附著。骨鈣素免疫組織化學(xué)染色胞漿呈棕黃色陽(yáng)性著色。培養(yǎng)21天茜素紅染色可見(jiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)。結(jié)論：優(yōu)化的原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，可為研究小鼠牙槽骨代謝中細(xì)胞生長(zhǎng)分化的調(diào)控機(jī)制提供合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

6、 第二部分： 目的：探討一氧化氮對(duì)小鼠原代牙槽骨成骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞前體細(xì)胞MC3T3-E1的礦化調(diào)控作用。方法：分別給于原代成骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1 NO外源性供體SNAP3周，檢測(cè)成骨細(xì)胞DNA含量和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性。Von Kossa方法檢測(cè)細(xì)胞合成鈣情況，RT-PCR檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合因子Cbfa1基因表達(dá)變化，Western Blot檢測(cè)骨唾

7、液酸蛋白(Bone Sialoprotein，BSP)表達(dá)變化。結(jié)果：和未加藥物對(duì)照組及礦化液作用組相比，SNAP可明顯增加成骨細(xì)胞DNA含量和堿性磷酸酶活性，培養(yǎng)2周后，細(xì)胞內(nèi)大量鈣鹽開(kāi)始沉積。Cbfa1基因在藥物作用的第3天表達(dá)上調(diào)到達(dá)高峰，到第7天表達(dá)逐漸下降，而培養(yǎng)14天可檢測(cè)到骨唾液酸蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。SNAP單獨(dú)應(yīng)用無(wú)明顯礦化作用。結(jié)論：一定濃度一氧化氮可加速小鼠原代培養(yǎng)的牙槽骨成骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系MC3T3-E1

8、增殖分化，并可能通過(guò)調(diào)控Cbfa1基因和骨唾液酸蛋白表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，刺激骨的礦化。 第三部分： 目的：探討一氧化氮對(duì)頜骨骨代謝的作用。方法：應(yīng)用藥物維A酸制作小鼠骨質(zhì)快速喪失模型。比較NO供體L-Arg，NOS抑制劑L-NAME對(duì)小鼠全身骨密度，股骨骨密度以及頜骨骨密度的變化，血清學(xué)檢測(cè)鈣、磷、堿性磷酸酶和骨鈣素的表達(dá)變化，免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨唾液酸蛋白表達(dá)。結(jié)果：L-NAME可加重模型組小鼠骨質(zhì)喪失，L-精氨酸