降鈣素基因相關(guān)肽對成骨細(xì)胞一氧化氮信號通路調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究-.pdf

1、周圍神經(jīng)所分泌的神經(jīng)肽類物質(zhì)對骨折修復(fù)重建和骨代謝具有重要生物學(xué)調(diào)控作用，部分神經(jīng)肽類物質(zhì)的促成骨作用在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中分別得以證實(shí)。降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin gene related peptide， CGRP）是其中研究較為詳盡的一類，自從在骨痂中發(fā)現(xiàn)CGRP 陽性神經(jīng)纖維表達(dá)開始，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠證明了CGRP的促成骨效應(yīng)，體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了成骨細(xì)胞表面有CGRP 受體存在，證實(shí)了CGRP 促進(jìn)成骨細(xì)胞

2、(Osteoblast，OB) 增殖的生物學(xué)效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)了其下游的環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphatec, cAMP)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Intracellular Ca 2+， [Ca 2+]I)和絲裂原激活激酶(Mitogen-activated protein kinase MAPK)等信號通路。
　　 一氧化氮(Nitric oxide, NO)作為一種信號傳導(dǎo)分子，是人體內(nèi)常見的第二

3、信使，研究證明NO能促進(jìn)骨折愈合初期的血管生成，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性，但目前尚無研究證明NO是否參與到CGRP對成骨細(xì)胞的調(diào)控信號通路中。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase, NOS)的內(nèi)皮型NOS(endotheliAlNOS, eNOS)，神經(jīng)元型nNOS(neuronAlNOS, nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS, iNOS)三類亞型在骨折愈合過程中的不同時期均有表達(dá)，

4、各自發(fā)揮不同的生理作用。人體對NO 生成的調(diào)控主要通過以下兩種方式進(jìn)行，一是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)型NOS(constitutive NOS, cNOS)的酶活力，包括了eNOS和nNOS，二是通過調(diào)節(jié)iNOS基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NO濃度。不同濃度的NO對成骨細(xì)胞有截然相反的生物學(xué)作用，cNOS 所合成的持續(xù)低濃度的NO 可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和骨基質(zhì)分泌功能，同時促進(jìn)前體破骨細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換和提高破骨細(xì)胞的細(xì)胞活性。由細(xì)胞炎癥因子所誘導(dǎo)

5、iNOS 產(chǎn)生的較高濃度NO對細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用，高濃度的NO 則會抑制成骨細(xì)胞DNA 合成、Ⅰ型膠原蛋白(Collegen）Ⅰ、骨鈣素(Osteocalcin, OC)產(chǎn)生和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性等。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在通過體外培養(yǎng)成骨樣細(xì)胞株MG-63，驗(yàn)證CGRP對MG-63細(xì)胞的增殖分化的生物學(xué)作用；在明確CGRP對MG-63細(xì)胞的生物學(xué)作用的基礎(chǔ)上，探討CGRP對NOS

6、酶活力和蛋白表達(dá)的調(diào)控，以及該調(diào)控對細(xì)胞NO 生成的作用；在明確CGRP與NO 生成的相關(guān)性后，探討CGRP對NO 生成的調(diào)控機(jī)制；最后探討MG-63細(xì)胞中CGRP-NO 調(diào)控的生物學(xué)意義。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞株購買于ATCC 公司，以5×106/瓶密度接種于100ml 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，加入含10％ FCS的高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于5％ CO2孵箱中37°C 孵育72 或96

7、h 傳代，6-8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.CGRP對MG-63細(xì)胞增殖和分化的作用：
　　 2.1增殖：MTT 法檢測CGRP對MG-63細(xì)胞增殖的量效作用(10-10-10-7 mol/L)和時效作用(24-96 h)；流式細(xì)胞儀檢測10-8 mol/L濃度的CGRP對MG-63細(xì)胞周期的時效作用(0-24 h)；RT-PCR 檢測10-8 mol/L濃度的CGRP對MG-63的c-fos/c-jun mRNA表達(dá)時

8、效作用(0-80m)；
　　 2.2分化：改良Kaplow 氏法檢測CGRP對MG-63細(xì)胞ALP 染色的量效作用(10-10-10-7 mol/L)；茜素紅染色檢測CGRP對MG-63 鈣化結(jié)節(jié)的量效作用(10-10-10-7 mol/L)；
　　 RT-PCR 檢測CGRP對MG-63細(xì)胞 Collagen ⅠmRNA表達(dá)的量效作用(10-10-10-7 mol/L)；ELISA 檢測CGRP對MG-63細(xì)胞OC表達(dá)

9、的量效作用(10-10-10-7 mol/L)。
　　 3.CGRP對MG-63細(xì)胞NO的調(diào)控作用：
　　 Griess 法檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度時效作用(0-48h)；激光共聚焦DAF-FM DA 熒光檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細(xì)胞中NO濃度時效作用(0-4 h)；NOS 酶活力試劑盒檢測10-8 mol/L的CGRP在作用1h后對MG-63細(xì)胞eNOS、

10、nNOS和iNOS 亞型酶活力的調(diào)控作用；免疫熒光檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細(xì)胞中eNOS、nNOS和iNOS 亞型表達(dá)的時效作用(0-48 h)。
　　 4.CGRP對MG-63細(xì)胞NO的調(diào)控機(jī)制：
　　 4.1CGRP通過[Ca 2+]I對MG-63細(xì)胞eNOS 酶活力的調(diào)控：
　　 激光共聚焦Fluo-3/AM 熒光檢測10-8 mol/L的CGRP對MG-63細(xì)胞中[Ca 2+]I的時

11、效作用(0-15 m)；激光共聚焦DAF-FM DA 熒光檢測L 型Ca 2+通道抑制劑verpamil對CGRP 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NO濃度增高的抑制作用；Griess 法檢測verpamil對CGRP 誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度增高的抑制作用。
　　 4.2 CGRP對MG-63細(xì)胞iNOSmRNA表達(dá)的調(diào)控作用：
　　 ReAltime PCR 檢測CGRP對MG-63 iNOS mRNA表達(dá)的時效作用(0-48 h)；

12、ReAltime PCR 檢測，在炎癥因子TNF-α和INF-γ誘導(dǎo)下CGRP對MG-63 iNOS mRNA表達(dá)的作用。
　　 5. MG-63中CGRP-NO 調(diào)控作用的生物學(xué)意義：
　　 5.1增殖：MTT 法檢測eNOS 抑制劑，50umol/L的L-NAME對MG-63細(xì)胞增殖的時效作用(24-96 h)；MTT 法檢測L-NAME對CGRP 誘導(dǎo)的MG-63 促增殖效應(yīng)的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測L-NAME對

13、CGRP 誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞周期改變抑制作用；Realtime PCR 檢測L-NAME對CGRP 誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞c-fos/c-jun mRNA表達(dá)改變的抑制作用。
　　 5.2分化：ReAltime PCR 檢測L-NAME對CGRP 誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞Collagen ⅠmRNA表達(dá)表達(dá)改變的抑制作用；ELISA 檢測L-NAME對CGRP 誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞OC表達(dá)改變的抑制作用結(jié)果。
　　 結(jié)論
　　

14、 1.CGRP對MG-63細(xì)胞具有顯著的促增殖效應(yīng)，以10-8 mol/L濃度作用最為明顯；
　　 CGRP對MG-63的促增殖效應(yīng)體現(xiàn)在激活A(yù)P-1的c-fos mRNA表達(dá)，加速細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，從而提高細(xì)胞增殖指數(shù)；CGRP 促進(jìn)MG-63細(xì)胞分化，細(xì)胞ALP 染色、礦化結(jié)節(jié)形成、Collagen ⅠmRNA表達(dá)及OC分泌均有顯著提高。
　　 2.CGRP能夠激活MG-63細(xì)胞eNOS 酶活力，升高細(xì)胞內(nèi)NO濃

15、度，從而使培養(yǎng)液中NO 產(chǎn)物濃度增加；CGRP對MG-63細(xì)胞的NOS 各亞型的蛋白表達(dá)無明確的調(diào)控作用。
　　 3.CGRP對細(xì)胞NO的上調(diào)作用主要是通過增加細(xì)胞內(nèi)的[Ca 2+]I，激活細(xì)胞eNOS 酶活力所完成的，而與iNOS mRNA表達(dá)調(diào)控?zé)o關(guān)；CGRP對在炎癥因子誘導(dǎo)下MG-63細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)無調(diào)控作用。
　　 4.通過抑制細(xì)胞內(nèi)eNOS 酶，有效抑制了CGRP對MG-63細(xì)胞c-fos mRNA