一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討小鼠骨髓來(lái)源的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及表面標(biāo)志物的鑒別。探討利用脂質(zhì)體介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的可行性。
　　方法:收集ICR小鼠骨髓EPCs，F(xiàn)icoll分離單核細(xì)胞，使用含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在細(xì)胞培養(yǎng)5、10、15及20d

2、后檢測(cè)細(xì)胞表面的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物。構(gòu)建、擴(kuò)增、提取并純化pcDNA3.0/eNOS基因質(zhì)粒;用EPC培養(yǎng)基配成2×105·mL細(xì)胞懸液按0.6mL/孔重新鋪6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％左右融合時(shí)，用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000體外轉(zhuǎn)染eNOS基因至EPC。轉(zhuǎn)染48h后，采用RT-PCR檢測(cè)EPC中eNOS的表達(dá)，硝酸還原酶法檢測(cè)EPC中一氧化氮(NO)的含量，熒光探針DCFH-DA活性氧檢測(cè)氧自由基(ROS)的含量。

3、　　結(jié)果:培養(yǎng)5d后細(xì)胞開始出現(xiàn)上皮細(xì)胞的形態(tài)，有偽足出現(xiàn);培養(yǎng)10d，細(xì)胞開始增殖，成圓形，出現(xiàn)梭形細(xì)胞;培養(yǎng)15d，細(xì)胞出現(xiàn)較為典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，鋪路石狀;培養(yǎng)20 d，細(xì)胞出現(xiàn)長(zhǎng)梭形拉網(wǎng)狀，即類似成熟內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光染色及流式定量檢測(cè)結(jié)果顯示，CD34在EPCs中的表達(dá)水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)有漸變減弱的趨勢(shì);VEGFR-2在EPCs的表達(dá)水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)有漸變?cè)鰪?qiáng)的趨勢(shì)。成功構(gòu)建pcDNA3.0/eNOS基因載體。轉(zhuǎn)染48