內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因轉(zhuǎn)移治療實(shí)驗(yàn)性賁門(mén)失弛緩癥.pdf

1、研究背景和目的:賁門(mén)失弛緩癥是一種食管動(dòng)力障礙性疾病,其特征是吞咽時(shí)平滑肌為主的下段食管缺乏蠕動(dòng)和下食管括約肌(LES)松弛障礙以及LES靜息壓力升高.主要癥狀是對(duì)液體和/或固體食物的吞咽困難.研究表明,賁門(mén)失弛緩癥患者支配LES的一氧化氮合酶(NOS)神經(jīng)缺失,膽堿能神經(jīng)保存完整,LES肌肉本身的舒縮功能正常.因此,抑制性神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮(NO)的合成障礙是導(dǎo)致LES不能松弛的根本原因.實(shí)驗(yàn)方法:1eNOS復(fù)制缺陷重組腺病毒的構(gòu)建4.

2、1kb的目的基因eNOS cDNA片段從eNOS-pcDNA3質(zhì)粒中酶切得到,定向克隆構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV-eNOS,經(jīng)Pme I線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183,利用細(xì)菌內(nèi)的同源重組機(jī)制構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-eNOS.pAd-eNOS經(jīng)Pac I線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成病毒顆粒Ad-eNOS,反復(fù)感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒,獲得高滴度的病毒上清.2eNOS在LES平滑肌細(xì)胞中的

3、體外表達(dá)取家貓LES組織,分離平滑肌后膠原酶消化成單個(gè)平滑肌細(xì)胞,用15％小牛血清的高糖DMEM(12mmol/L)培養(yǎng),并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及電鏡觀察進(jìn)行鑒定.4eNOS基因轉(zhuǎn)移對(duì)貓賁門(mén)失弛緩癥的治療療效觀察將18只貓賁門(mén)失弛緩癥動(dòng)物模型隨機(jī)分為治療組(eNOS組,n=10)與對(duì)照組(GFP組,n=8),并將6只健康貓?jiān)O(shè)為空白對(duì)照組(NS組,n=6).在eNOS組動(dòng)物L(fēng)ES內(nèi)注射1ml10<'12>pfu/L的Ad-eNOS,GFP

4、組動(dòng)物注射1ml 10<'12>pfu/L的Ad-GFP,NS組注射1ml病毒貯存液.分別在注射后3天、1周、2周、3周、4周時(shí)測(cè)定3組動(dòng)物L(fēng)ES靜息壓力和LES的松弛功能,并在各時(shí)間點(diǎn)采用Western blot、RT-PCR及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)eNOS在LES中的表達(dá),測(cè)定基因表達(dá)產(chǎn)物eNOS活性以及LES組織中NO含量,并觀察L-Arg、L-NAME、SNP等藥物對(duì)LES靜息壓力和離體肌條張力的影響以及肌條對(duì)電場(chǎng)刺激的反應(yīng).

5、5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(<'->X±s)表示,感染前后自身對(duì)照采用配對(duì)t檢驗(yàn),感染以后多個(gè)處理組間采用F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05為顯著性差異.實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.利用細(xì)菌內(nèi)同源重組法成功構(gòu)建了攜帶牛eNOS基因全長(zhǎng)cDNA序列的復(fù)制缺陷重組腺病毒Ad-eNOS,并通過(guò)擴(kuò)增獲得了高滴度的病毒上清.2.成功在體外原代培養(yǎng)了貓LES平滑肌細(xì)胞,培養(yǎng)的LES平滑肌細(xì)胞純度和存活率均超過(guò)了93％,能夠滿足一般的體外實(shí)驗(yàn)研究.3.重組

6、病毒Ad-eNOS能夠高效感染體外培養(yǎng)的LES平滑肌細(xì)胞,并介導(dǎo)eNOS基因在平滑肌細(xì)胞中高效表達(dá),基因表達(dá)產(chǎn)物具備eNOS正常的生物化學(xué)特性,酶的活性受Ca<,2+>濃度的生理性調(diào)節(jié),能夠催化L-精氨酸產(chǎn)生NO.4.采用胃鏡下在貓LES環(huán)周注射BAC的方法,可成功去除貓LES肌間神經(jīng)叢NOS陽(yáng)性神經(jīng)元,制備出模擬性良好的貓賁門(mén)失弛緩癥動(dòng)物模型.該方法可以避免開(kāi)胸注射BAC對(duì)動(dòng)物L(fēng)ES周?chē)M織的損傷,制備的模型更為可靠.5.重組病毒Ad