骨發(fā)育中生物學(xué)信息的表達(dá)模式及HIF-1α調(diào)控作用.pdf

1、人體骨骼形成有兩種方式：膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。局部因子、激素等空間位置信息的調(diào)控，是骨遺傳、代謝、修復(fù)的基礎(chǔ)。低氧誘導(dǎo)因子-10α(hypoxia inducible factor-1α，HTF-1α)在胚胎正常發(fā)育中的作用早已引起重視，但對(duì)低氧及其主要適應(yīng)性調(diào)節(jié)因子HTF-1α在骨發(fā)育中的作用只是在近年才逐漸得以認(rèn)識(shí)，受到關(guān)注。 對(duì)骨與關(guān)節(jié)病損的有效防治，依賴于對(duì)產(chǎn)生骨與關(guān)節(jié)細(xì)胞的分子生物學(xué)行為調(diào)控機(jī)制的深刻理解。這就需要更

2、深入細(xì)致地認(rèn)識(shí)其發(fā)育過(guò)程，深入了解影響骨骼系統(tǒng)形成的主要調(diào)控因素及其作用機(jī)制，進(jìn)一步明確骨和關(guān)節(jié)形成過(guò)程中相互之間的耦聯(lián)模式，為骨和軟骨修復(fù)及組織工程化骨的構(gòu)建提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 目的：為深入理解骨發(fā)育的基本過(guò)程及其機(jī)制；探尋影響骨發(fā)育的主要影響因素及其調(diào)控機(jī)理；探討發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)演變與生物學(xué)特征變化的關(guān)系；進(jìn)一步探討和加深了解HIF-1α在骨發(fā)育、骨形成中可能存在的調(diào)控作用。 方法：取孕9.5天(E9.5)到18.

3、5天(E18.5.5)小鼠胚胎，解剖鏡下觀察胚胎肢芽和椎體發(fā)育過(guò)程的大體形態(tài)演變過(guò)程；分別以阿利辛蘭和茜素紅整體染色、組織化學(xué)染色及TUNEL染色觀察發(fā)育中軟骨的形成及骨化過(guò)程、組織細(xì)胞學(xué)的演變、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌變化以及軟骨細(xì)胞的凋亡過(guò)程；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)骨發(fā)育過(guò)程中的主要相關(guān)基因在不同時(shí)期和不同位置的表達(dá)變化；進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR、原位雜交、免疫組織化學(xué)及Western印跡等技術(shù)和方法檢測(cè)肢芽和椎體骨發(fā)育過(guò)程中HIF-α

4、1的表達(dá)和分布，及與相關(guān)調(diào)控基因VEGF和RUNX2的表達(dá)。 結(jié)果：EIO.5時(shí)，見(jiàn)肢芽原基開(kāi)始出現(xiàn)；E14.5時(shí)，在長(zhǎng)骨中心呈現(xiàn)不透光骨化影，其中的軟骨細(xì)胞開(kāi)始增殖肥大凋亡，成骨細(xì)胞伴隨血管的侵入長(zhǎng)入軟骨中心，初級(jí)骨化中心開(kāi)始發(fā)生；其后骨化中心不斷向兩端延伸。E13.5時(shí)，脊柱仍由透光的軟骨性椎體組成；E15.5時(shí)，椎體內(nèi)形成小的骨化核；骨化中心接著不斷膨大生長(zhǎng)。 肢芽中SOX9自E12.5至E15.5均大量表達(dá)，其后

5、稍降低表達(dá)直至骨骼發(fā)育成熟；而椎體中SOX9在E13.5出現(xiàn)表達(dá)高峰，E14.5仍大量表達(dá)，E15.5時(shí)迅速下降，表達(dá)時(shí)相較肢芽?jī)?nèi)短。椎體中Ihh、HIF-1α、VEGF、BMP、OPG、CO110的基因表達(dá)都較肢芽中同一發(fā)育階段表達(dá)提前，而椎體中OC表達(dá)卻較晚，表達(dá)量也較肢芽中少。 定量PCR顯示HIF1αmRNA在肢芽的E13.5--E15.5呈現(xiàn)高峰表達(dá)，E13.5時(shí)較高表達(dá)，E14.5時(shí)表達(dá)最高，E15.5開(kāi)始回落；VE

6、GF的mRNA表達(dá)時(shí)相與其高度一致(r<0.05)；RUNX2 mRNA在肢芽的E13.5--E16.5達(dá)到表達(dá)高峰。原位雜交示E14.5時(shí)肢芽軟骨中心呈HIF-1 α mRNA大量表達(dá)的熒光增強(qiáng)區(qū)；免疫組化見(jiàn)軟骨中心內(nèi)大量HIF-1 α蛋白陽(yáng)性表達(dá)的黃色顆粒；免疫組化還示VEGF蛋白在成骨初期的軟骨中心和軟骨膜內(nèi)也都大量表達(dá)。Western blot結(jié)果示HIF-1 α蛋白在E12.5時(shí)有少量表達(dá)，E13-5時(shí)表達(dá)開(kāi)始增加，持續(xù)高水平

7、表達(dá)至E16-5，其后表達(dá)水平很快回落；VEGF蛋白表達(dá)模式與其具有一致性。 結(jié)論： 1．椎體的成骨過(guò)程與肢芽骨發(fā)育一樣，也是先在軟骨內(nèi)形成初級(jí)骨化中心，進(jìn)一步骨化后代替軟骨的軟骨內(nèi)成骨過(guò)程；但與肢芽?jī)?nèi)長(zhǎng)骨發(fā)育不同的是，其成骨方向?yàn)榉派錉钕蛩闹芘蛎?，而不同于長(zhǎng)骨發(fā)育的向兩端延伸性成骨過(guò)程。 2．肢芽和椎體骨發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)演變與生物學(xué)特征變化密切關(guān)聯(lián)，受各種生物學(xué)信息調(diào)控，后者在發(fā)育各期呈現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)基因表達(dá)