低氧高糖環(huán)境下載HIF-1αsiRNA納米粒的MSCs對RPE細胞生物學特性及HIF-1α表達的影響研究.pdf

1、目的:
　　探討使用骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）作為細胞載體搭載包埋缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）siRNA的聚乳酸聚乙醇酸納米粒（PLGA NPs）對模擬糖尿病微環(huán)境刺激下視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞的影響。
　?。?）原代培養(yǎng)人MSCs并鑒定，在低氧高糖環(huán)境下對MSCs的生物學特性進行觀察；
　?。?）使用PLGA包載人HIF-1αsiRNA并評測納米粒相關(guān)指標以及觀察MSCs的入胞情況；
　?。?）檢測

2、PLGA納米粒對RPE細胞HIF-1α的沉默情況；
　?。?）觀察載有包埋HIF-1αsiRNA納米粒的MSCs對低氧高糖環(huán)境下RPE細胞生物學特性以及HIF-1α的mRNA表達的影響。
　　方法:
　?。?）使用密度離心法提取人MSCs，通過成骨和成脂誘導后分別使用茜素紅和油紅O進行染色鑒定。流式細胞術(shù)鑒定其表面標記物。通過物理性缺氧模型（低氧CO2培養(yǎng)箱）以及葡萄糖建立低氧高糖模型，按照氧濃度及糖濃度將實驗分為：A

3、.常氧常糖組（21％O2+5.56mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）；B.常氧高糖組（21%O2+30mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）；C.低氧常糖組（5%O2+5.56mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）；D.低氧高糖組（5%O2+30mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液）。使用CCK-8在12h、24h和48h分別檢測MSCs的增殖情況，流式細胞術(shù)在24 h檢測MSCs凋亡情況，Transwell在24h檢測MSCs移行情況；
　

4、?。?）由上海吉凱公司構(gòu)建針對人NM_001530（HIF-1α）基因的質(zhì)粒和慢病毒，乳化-揮發(fā)法制備載HIF-1αsiRNA的PLGA納米粒，激光粒度分析及Zeta電位分析檢測PLGA納米粒的粒度分布范圍，掃描電鏡觀察納米粒表面形態(tài)；使用流式細胞術(shù)對轉(zhuǎn)染載有HIF-1αsiRNA的MSCs的入胞率進行檢測；
　?。?）將實驗分為：A.陰性對照組（不做任何處理）；B.慢病毒組（使用構(gòu)建好的慢病毒對細胞進行轉(zhuǎn)染）；C.裸質(zhì)粒組（使用

5、構(gòu)建好的質(zhì)粒對細胞進行轉(zhuǎn)染）；D.空白PLGA組（使用γ射線消毒過的，不含質(zhì)粒的PLGA納米粒對細胞進行轉(zhuǎn)染）；E.PLGA+siRNA組（使用γ射線消毒過的，包埋有HIF-1αsiRNA的納米粒對細胞進行轉(zhuǎn)染）。實時定量PCR檢測1d、3d、7d時RPE細胞中HIF-1αmRNA的相對表達量；
　?。?）使用Transwell建立MSCs/RPE細胞共培養(yǎng)體系，將實驗分為：A.RPE組（在低氧高糖環(huán)境下對單純的RPE細胞進行培養(yǎng)

6、并檢測）；B.共培養(yǎng)組（在低氧高糖環(huán)境下對MSCs+RPE細胞共培養(yǎng)模型進行培養(yǎng)并檢測）；C.載PLGA+siRNA共培養(yǎng)組（在低氧高糖環(huán)境下對搭載有含HIF-1αsiRNA納米粒的MSCs+RPE細胞共培養(yǎng)模型進行培養(yǎng)并檢測）。使用CCK-8在12h、24h和48h分別檢測RPE細胞的增殖情況，流式細胞術(shù)在24h檢測RPE細胞的凋亡情況，Transwell在24h檢測RPE細胞的移行情況；實時定量PCR檢測1d、3d、7d時RPE細胞

7、中HIF-1αmRNA的水平。
　　結(jié)果:
　?。?）提取的人MSCs呈貼壁生長，經(jīng)鑒定具有向成骨細胞和成脂細胞多向分化的潛能。流式細胞術(shù)檢測表面標記物顯示：CD29（+），CD34（－），CD45（－）。低氧高糖組較常氧常糖組 MSCs的增殖能力（2.25±0.14vs1.28±0.16；3.14±0.19vs1.88±0.11）在24h和48h時和移行（130±7.07vs72±5.66）能力在24h均增強（P<0.05

8、），凋亡情況無差異（P>0.05）；
　?。?）納米粒呈窄分布，平均粒徑為314.1nm，Zeta電位為﹣0.36mV。掃描電鏡觀察納米粒表面光滑，呈球形。流式細胞術(shù)檢測納米粒入胞率為（67.3±5.2）%；
　?。?）相較慢病毒組（<3d）而言，PLGA組可長期（7d）對RPE細胞中HIF-1αmRNA的表達進行有效抑制（7d時HIF-1αmRNA表達量：1.13±0.27（慢病毒組）vs0.63±0.23（PLGA組）；

9、F=37.48，P<0.05），抑制率可達到30-50%，單純質(zhì)粒組以及空白PLGA組與陰性對照組的結(jié)果一致（F=2.74，P>0.05）。
　　（4）在體外共培養(yǎng)體系中，與單純RPE細胞組及不載藥的共培養(yǎng)組相比，載藥的共培養(yǎng)組對低氧高糖環(huán)境下RPE細胞的增殖，凋亡及移行的影響均沒有差異（P>0.05）；1d、3d和7d時，載有PLGA緩釋載藥系統(tǒng)的MSCs作為載體可較長期、有效的沉默RPE細胞中HIF-1αmRNA的表達（F=4