急性脊髓損傷的生物信息學(xué)分析及相關(guān)基因HIF-1α的表達(dá)分析.pdf

1、背景:
　　脊髓損傷(SCI)一般情況下定義為脊椎脊髓受到傷害而造成其主要功能包括運(yùn)動(dòng)，感覺(jué)，自主神經(jīng)和反射等功能的完全或者部分的喪失，是臨床上一種常見(jiàn)的嚴(yán)重的致殘性損傷，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。脊髓損傷的病理生理過(guò)程的研究對(duì)促進(jìn)其綜合性藥物干預(yù)措施的研究至關(guān)重要。繼發(fā)于脊髓原發(fā)損傷的繼發(fā)性損傷所產(chǎn)生的損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了原發(fā)性損傷，是發(fā)生于細(xì)胞和分子水平的一個(gè)主動(dòng)調(diào)節(jié)過(guò)程，是可以受調(diào)控因素影響的，所以這個(gè)過(guò)程具有可逆性且可被控制。

2、目前對(duì)于SCI的研究主要集中在脊髓損傷后基因表達(dá)的變化方面。
　　基因芯片(gene chip)又可以稱(chēng)之為DNA微陣列(DNA microarray)，這項(xiàng)技術(shù)是伴隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃而產(chǎn)生的，他是目前生命科學(xué)領(lǐng)域當(dāng)中的前沿性生物技術(shù)之一?；蛐酒@著的特點(diǎn)是它所具有的高通量、高集成、多樣化、微型化以及自動(dòng)化等相關(guān)特性。經(jīng)過(guò)最近特別是近十幾年的發(fā)展，基因芯片已經(jīng)在相關(guān)的研究中的基因表達(dá)分析、疾病的基因診斷、藥物的基因組學(xué)等諸多領(lǐng)域

3、發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，并且在未來(lái)的相關(guān)生物研究中中具有巨大的研究和應(yīng)用前景。集合了多種mRNA表達(dá)譜的基因芯片可以篩選大鼠脊髓損傷后脊髓內(nèi)的差異表達(dá)基因。通過(guò)篩選出的相關(guān)基因可以很方便、快速地了解和認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，為疾病診斷的確定和提供恰當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁┯辛ι镝t(yī)學(xué)技術(shù)的保證。
　　現(xiàn)在脊髓損傷的動(dòng)物模型有多種，例如球囊壓迫，擠壓，鉗夾，側(cè)切，全切，脊椎橫斷，挫傷和去除一部份脊髓組織。為更好的模擬脊髓損傷的原發(fā)和繼發(fā)的

4、損傷過(guò)程，我們采用大鼠鉗夾實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yīng)用血管夾(vascular clip)損傷脊髓組織，對(duì)脊髓組織進(jìn)行擠壓但是保持硬脊膜的完整性。所建立的動(dòng)物模型具有簡(jiǎn)單、廉價(jià)并且高度可重復(fù)性。
　　缺血(ischemia)越來(lái)越多的被認(rèn)為是急性脊髓損傷的病理生理變化的一個(gè)焦點(diǎn)，它可能是引起和加重急性脊髓損傷繼發(fā)性損傷的重要原因。低氧誘導(dǎo)因子是迄今發(fā)現(xiàn)的組織細(xì)胞在低氧狀態(tài)下誘生的最直接或唯一的調(diào)控因子，是調(diào)節(jié)低氧狀態(tài)下細(xì)胞分化和存活的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)

5、因子。在相關(guān)的脊髓損傷的生物信息學(xué)分析中我們發(fā)現(xiàn)HIF-1可能是脊髓損傷中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。我們通過(guò)自己建立的改良大鼠脊髓損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用RT-PCR,Western blot,原位雜交，ELISA等檢測(cè)方法，檢測(cè)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1及其靶基因VEG、EPO的表達(dá)并分析它們與脊髓損傷的相關(guān)性和相互之間的相關(guān)性。同時(shí)，結(jié)合臨床檢測(cè)脊髓損傷患者外周血中的VEG、EPO的表達(dá)情況，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比研究，探討HIF-1及其靶基因VEG

6、、EPO在繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用，從而為臨床治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.本實(shí)驗(yàn)的目的為使用集合了多種mRNA表達(dá)譜的基因芯片來(lái)篩選大鼠脊髓損傷后脊髓內(nèi)的差異表達(dá)基因，及脊髓損傷后差異表達(dá)的上調(diào)基因和下調(diào)基因。
　　2.建立一種改良大鼠脊髓損傷模型，并評(píng)價(jià)其可重復(fù)性及可操作性;
　　3.探究低氧誘導(dǎo)因子及其靶基因在脊髓損傷后的缺氧耐受及血管新生相關(guān)的病理生理過(guò)程中的表達(dá)。
　　方

7、法:
　　1.1選擇NCBI基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片數(shù)據(jù)(Gene ExpressionOmnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).選取GSE2270基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)。
　　1.2使用R語(yǔ)言的limma數(shù)據(jù)包，通過(guò)與相應(yīng)的對(duì)照組對(duì)比，確定脊髓損傷后的差異表達(dá)基因(DEGs)。
　　1.3采用Cytoscape軟件及其插件對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析。
　　1.4使用D

8、AVID(Database for Annotation, Visualization and IntegratedDiscovery，http://www.david.niaid.nih.gov)網(wǎng)絡(luò)工具，通過(guò)超幾何分布法，對(duì)差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行通路功能富集分析，計(jì)算在通路中的P值。所得數(shù)據(jù)與KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配。
　　1.5使用DiRE數(shù)據(jù)庫(kù)分析富集在細(xì)胞通路上的DEGs，尋找每一個(gè)細(xì)胞通路上的調(diào)控元件。

9、　　2.采用鉗夾法建立大鼠急性脊髓損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀２捎蒙窠?jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)BBB評(píng)分體系評(píng)價(jià)模型的神經(jīng)功能，采用HE染色和尼氏染色評(píng)價(jià)脊髓損傷脊髓的病理變化。
　　3.1、通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)脊髓損傷后不同時(shí)相HIF-1α mRNA的變化。
　　3.2、原位雜交及免疫組化方法分析脊髓損傷后不同時(shí)相脊髓組織內(nèi)HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　3.3、采用Western blot及TUNEL染色方法分析不同時(shí)相AI

10、F和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平，觀(guān)察脊髓內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。
　　3.4、采用ELISA方法檢測(cè)臨床脊髓損傷患者外周血內(nèi)VEGF EPO的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)生物信息學(xué)分析，共確定了173個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中130個(gè)上調(diào)基因，43個(gè)下調(diào)基因。這些DEGs富集于不同的GO，如損傷應(yīng)答、炎癥應(yīng)答和免疫應(yīng)答等。通過(guò)DEGs的通路富集分析，8條通路被顯著富集，如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用

11、通路，Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路等。在每一條通路中，都有顯著的調(diào)控元件和調(diào)控因子，其中缺氧誘導(dǎo)因子、同源框蛋白BEL1是兩個(gè)含量最高的調(diào)控因子，RAC2是處于焦點(diǎn)位置的調(diào)控因子。通過(guò)分析確定了幾個(gè)關(guān)鍵基因，HIF1，BAC2，CD44，和ARPC1B，它們都通過(guò)不同的通路參與SCI疾病的進(jìn)展。
　　2.鉗夾大鼠急性脊髓損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?，?shí)驗(yàn)組的BBB評(píng)分同對(duì)照組相比，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。對(duì)照組HE和尼

12、氏染色基本正常，實(shí)驗(yàn)組顯示隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，脊髓病理學(xué)變化逐漸加重，脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元更明顯，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元尼氏體淡染或消失。
　　3.1、RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常的脊髓中HIF-1α保持在較低水平;脊髓損傷后6-72小時(shí)，HIF-1α的表達(dá)明增加;1周后，其表達(dá)開(kāi)始下降。HIF-1α mRNA的表達(dá)是與脊髓損傷后缺血程度相互平行，尤其是在傷后2-3天HIF-1α的表達(dá)達(dá)到峰值。
　　3.2、損傷脊髓組織原位雜交顯示:幾

13、乎所有的損傷區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞都表達(dá)HIF-α mRNA的，而在正常的脊髓表達(dá)非常弱。
　　3.3、免疫組化顯示損傷脊髓內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯增加，其趨勢(shì)和HIF-1α mRNA的表達(dá)基本一致，但是蛋白的表達(dá)要比mRNA的表達(dá)要早。VEGF、EPO在正常脊髓組織中表達(dá)呈現(xiàn)一個(gè)低水平，在脊髓損傷的大鼠模型中損傷后的24小時(shí)表達(dá)開(kāi)始增加，48-72小時(shí)中達(dá)到峰值并且逐漸下降。
　　3.4、應(yīng)用Western blots印跡技術(shù)

14、檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的脊髓的AIF和caspase-3蛋白的表達(dá)水平。傷后6小時(shí)組AIF、caspase-3蛋白的表達(dá)顯著增加，3d時(shí)達(dá)高峰，7d凋亡相關(guān)基因表達(dá)逐日減少。TUNEL染色檢測(cè)各組脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。對(duì)照組手術(shù)組中只觀(guān)察到少數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。然而，在損傷后6小時(shí)組、12小時(shí)、24小時(shí)組觀(guān)察到具有高熒光信號(hào)的較多TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，3d時(shí)凋亡細(xì)胞量最多，7d開(kāi)始減少。
　　3.5、脊髓損傷患者外周血ELISA法

15、檢測(cè)HIF-1α調(diào)控下游基因VEGF、EPO在外周血的表達(dá)明顯的升高，與正常人外周血比較差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.經(jīng)基因本體及其富集的通路研究發(fā)現(xiàn)，SCI主要與炎癥和免疫有關(guān)。CD44可能是脊髓損傷進(jìn)展過(guò)程中免疫應(yīng)答的刺激因子。在脊髓損傷發(fā)病機(jī)制中RAC2與HIF1有明顯的相互作用，并起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。ARPC1B在調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和活性中起基礎(chǔ)性作用。
　　2.經(jīng)過(guò)我們改良的脊髓損傷模型可以模擬不同程度

16、的脊髓損傷，并且可靠、簡(jiǎn)單具有高度重復(fù)性，病理改變穩(wěn)定。
　　3.研究表明在脊髓損傷后，HIF-1a通過(guò)增加蛋白的穩(wěn)定性和上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性，其蛋白表達(dá)增加。隨著HIF-1a表達(dá)的上調(diào)其相應(yīng)的靶基因EPO和VEGF也隨之表達(dá)增加。結(jié)合病理過(guò)程發(fā)現(xiàn)HIF-1a表達(dá)上調(diào)可能參與了脊髓損傷后的低氧耐受、細(xì)胞凋亡和血管微環(huán)境的重建。
　　4.我們的研究證實(shí)在急性損傷后脊髓細(xì)胞可能通過(guò)細(xì)胞凋亡造成脊髓組織的損害，這可能和臨床上相關(guān)的神經(jīng)癥狀