LncRNA在肺癌中的表達及調(diào)控機制研究.pdf

1、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度一般超過200nt的非蛋白編碼RNA，主要從表觀遺傳、轉錄調(diào)控及轉錄后調(diào)控等層面調(diào)控基因表達。近年來研究表明多種lncRNA在腫瘤組織與正常組織中的表達有著明顯的差異，且lncRNA與人類疾病的發(fā)生有關，尤其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。肺癌作為常見的惡性腫瘤，嚴重影響人類的健康，尋找有效的生物標志物亟待解決。因此，肺癌相關lncRNA的篩選和調(diào)控機制研

2、究逐漸成為當今科學界研究的熱點之一。前期已選取質(zhì)檢通過的3對肺癌組織及正常對照組織進行了lncRNA/mRNA表達譜芯片檢測，篩選出了肺癌相關特異性lncRNA。因此，本研究在此基礎上通過構建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，結合生物信息學分析，篩選了5個肺癌相關候選lncRNA，通過實時熒光定量PCR(RT-qRCR)檢測它們在肺癌中的表達水平，識別其與肺癌發(fā)病風險之間的關系，對其進行臨床病理參數(shù)相關性分析以及對肺癌的診斷價值分析，探

3、討lncRNASFTA1P對細胞生物學行為的影響及調(diào)控機制，為了解其在肺癌細胞中的作用以及對肺癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控提供依據(jù)。
　　一、肺癌相關lncRNA的生物信息學分析
　　在前期通過lncRNA/mRNA表達譜芯片篩選出肺癌相關lncRNA和mRNA的基礎上，本研究構建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，結合在共表達網(wǎng)絡中的貢獻度以及芯片檢測的差異倍數(shù)，從中挑選出5個肺癌相關候選lncRNA，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對其進行GO功

4、能注釋和KEGGPathway分析。結果顯示共表達網(wǎng)絡含有245個肺癌相關差異表達lncRNA和108個肺癌相關差異表達mRNA，篩選出的5個肺癌相關候選lncRNA分別是RP11-417J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599、AL133118。生物信息學分析顯示候選lncRNA相關mRNA的功能注釋和可能參與的信號通路均與癌癥密切相關。
　　二、肺癌相關候選lncRNA在人群中的表達水平分析
　

5、　本研究收集95例原發(fā)性肺癌患者的癌組織和配對癌旁組織，利用RT-qPCR對人群組織樣本中5個候選lncRNA表達水平進行檢測，條件logistic回歸分析候選lncRNA對肺癌發(fā)病風險的影響，通過ROC曲線評價其在肺癌診斷中價值，應用卡方檢驗分析其與臨床病理參數(shù)的相關性。結果顯示RP11-417J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599和AL133118在肺癌組織中的表達水平分別為癌旁組織的27.1％、18％、

6、5.9％、40.8％和12.6％，均在肺癌組織中低表達，與芯片檢測結果一致。它們在組織中的表達水平△CT每升高一個單位，肺癌的發(fā)病危險性分別增加29.9％、63.6％、118.4％、17.1％和47.8％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示其表達水平與肺癌發(fā)病風險呈負相關。這些lncRNA單獨作為指標對肺癌診斷有一定效力，聯(lián)合診斷AUC為0.930(P＜0.01)，效果更佳。SFTA1P的表達水平與病理類型密切相關(P＜0.001)

7、，且在鱗癌(0.018±0.128)中的表達水平低于腺癌(0.144±0.176)，與性別、年齡、TNM分期無關(P＞0.05)。RP11-417J8.6-201、BC042023、BC036599和AL133118的表達水平與性別、年齡、病理類型、TNM分期均無關(P＞0.05)。
　　三、SFTA1P在肺癌細胞中的生物學功能及調(diào)控機制研究
　　應用RT-qPCR方法在四種肺癌細胞株和兩種肺正常細胞株中檢測RP11-417

8、J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599及AL133118本底值表達情況。利用慢病毒為載體使A549細胞過表達SFTA1P，通過嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達細胞株，應用MTT和流式細胞術檢測SFTA1P對A549細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響。應用RT-qPCR和Western Blot技術檢測過表達SFTA1P對PI3K-AKT信號通路關鍵基因和蛋白表達水平的變化。結果顯示，RP11-417J8.6-201、S

9、FTA1P、BC036599、AL133118在肺癌細胞A549、NCI-H1395、SBC-5中表達量較低，在正常細胞HPAEPIC中的表達量較高。BC042023在肺癌細胞A549、NCI-H1395中的表達量較低，在正常細胞16HBE中的表達量較高。過表達SFTA1P可使細胞周期S期阻滯，G1期減少(P＜0.05)，對細胞增殖和細胞凋亡沒有明顯影響(P＞0.05)，提示SFTA1P可能通過對A549細胞周期的影響促進肺癌的發(fā)生發(fā)展

10、。過表達SFTA1P可使PI3K-AKT信號通路關鍵蛋白VEGF-D、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示SFTA1P可能通過抑制PI3K-AKT信號通路的活化來影響肺癌細胞的生物學行為。
　　綜上所述，本研究通過構建lncRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡，共篩選出245個肺癌相關差異表達lncRNA和108個肺癌相關差異表達mRNA。結合生物信息學分析，從中選擇了5個肺癌相關候

11、選lncRNA開展進一步研究，即RP11-417J8.6-201、BC042023、SFTA1P、BC036599及AL133118。人群中的表達水平檢測發(fā)現(xiàn)它們均在肺癌組織中低表達，其表達水平與肺癌發(fā)病風險呈負相關，5個候選lncRNA聯(lián)合對肺癌的診斷價值較高，分析還發(fā)現(xiàn)SFTA1P的表達水平與病理類型密切相關，且在鱗癌中的表達水平顯著低于腺癌。對SFTA1P的生物學功能與調(diào)控機制研究顯示，過表達SFTA1P可使肺癌細胞周期S期阻滯，