LncRNA AFAP1-AS1在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義.pdf

1、背景與目的:
　　肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率明顯升高，在2013年，肺癌估計占所有女性癌癥死亡的26％和所有男性癌癥死亡的28％，至今，肺癌已成為全世界癌相關性死亡的主要原因。在中國，肺癌的發(fā)病率逐年快速上升，在過去的幾十年里，肺癌死亡率增加了465%，其死亡率在城市中居首位，在農(nóng)村中位于第二位。在所有的肺癌中，非小細胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC）占75-

2、80%。盡管臨床和實驗腫瘤學均取得了許多新的進展，但是肺癌的預后仍不如人意，5年生存率只有約11%。造成肺癌高死亡率的主要原因是患者確診時腫瘤細胞已經(jīng)發(fā)生了侵襲和轉(zhuǎn)移，缺乏有效的治療措施。因此，為了給肺癌患者提供有效的治療策略，提高肺癌患者的生存率，必須積極尋找有效的早期診斷及預后標志物。
　　全基因組分析表明，人類基因組中編碼蛋白的基因不到2%，超過90%的基因被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA）。

3、這些ncRNA從長度上劃分可以分為兩類：短片段非編碼RNA(short ncRNAs)和長片段非編碼RNA（long ncRNAs，lncRNAs）。lncRNA是一類長度大于200nt的非編碼RNA。眾所周知，lncRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其與多種癌癥的生物學過程有關，比如癌癥的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程。雖然基因組分析發(fā)現(xiàn)了大量的lncRNAs，但目前只有少部分lncRNAs被廣泛用于研究，其中較為突出的是HOTAIR、

4、MALAT-1，自從lncRNAs研究熱潮開辟以來，這兩個lncRNAs的功能和分子機制已經(jīng)被廣泛研究，腫瘤臨床相關研究還發(fā)現(xiàn)，這些lncRNAs具有作為腫瘤診斷、預后分子標志物的潛力，其表達水平與多種腫瘤的臨床病理特征以及預后相關。
　　反義lncRNAs（NATs,Natural antisense transcripts）是一類從蛋白或非蛋白編碼基因的相反鏈上轉(zhuǎn)錄而來的lncRNAs，現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)NATs在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)

5、揮了重要的作用。AFAP1-AS1是一個首先在Barrett食管和食管腺癌中被發(fā)現(xiàn)的lncRNA，是蛋白編碼基因AFAP1的NATs，它在Barrett食管和食管腺癌中低甲基化、高表達。隨后的實驗表明敲低AFAP1-AS1抑制食管腺癌細胞的增殖以及侵襲能力。本實驗室的胃癌組織芯片也表明AFAP1-AS1在胃癌組織中高表達。雖然如此，AFAP1-AS1與非小細胞肺癌臨床病理特征相關性的研究暫時無報道。因此，本研究通過qRT-PCR方法檢測

6、AFAP1-AS1在NSCLC患者肺癌組織及其對應的正常肺組織標本中的表達情況，并對患者的臨床病理特征進行分析，揭示AFAP1-AS1在非小細胞肺癌中的可能作用，并探討AFAP1-AS1與AFAP1在非小細胞肺癌中的潛在關聯(lián)。
　　方法：
　　1.病人與組織樣本收集廣州軍區(qū)總醫(yī)院胸外科2012年12月至2013年12月行根治性或姑息性切除術的65例非小細胞肺癌原發(fā)病灶及癌旁組織（癌旁組織距離癌組織達5cm以上），同時收集患者

7、個人信息和詳細臨床資料。
　　2.細胞株及培養(yǎng)正常肺支氣管上皮細胞16HBE和肺癌上皮細胞株A549、H1299、H460以及95-D用RPMI-1640完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的濕潤條件下培養(yǎng)。
　　3.總RNA提取和qRT-PCR分析使用TRIzol? isolation reagent按照說明書提取凍存肺癌組織及癌旁正常組織總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；用qRT-PCR方法在7500熒光定量PCR儀上進行相

8、對定量分析。
　　4.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，以α=0.05作為檢驗水準。配對樣本均數(shù)間的比較采用配對樣本t檢驗。AFAP1-AS1表達、AFAP1表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的相關性采用χ2分析。AFAP1-AS1表達水平與AFAP1表達水平的相關性用Spearman相關分析來分析。
　　結果:
　　1. AFAP1-AS1在非小細胞肺癌組織以及細胞株中的表達情況在65例非小細胞肺癌患者中，5

9、0.8%（33/65）的癌組織中AFAP1-AS1表達水平明顯高于對應的正常癌旁組織中的水平（P＜0.05）。同時AFAP1-AS1在肺癌細胞株H1299、H460中均呈高表達。
　　2.非小細胞肺癌中AFAP1-AS1表達與臨床病理特征的相關性非小細胞肺癌組織中的AFAP1-AS1的表達水平與非小細胞肺癌的組織學類型有關（P＜0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期均無相關性（P＞0.05）
　　

10、3.AFAP1-AS1表達水平與AFAP1表達水平的相關性 AFAP1-AS1表達水平與AFAP1表達水平呈顯著正相關（r=0.548，P＜0.05），且AFAP1的表達水平與非小細胞肺癌的組織學類型有關（P＜0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期均無相關性（P＞0.05）
　　結論:
　　1. AFAP1-AS1在非細胞肺癌組織和細胞株中均呈高表達，在癌癥的發(fā)生過程中可能具有類癌基因的功能，與非