CT基因PIWIL1在肺癌中異常表達(dá)及分子機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重影響人類健康的一類疾病，肺癌更是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。2012年全球肺癌的新發(fā)病例約180萬人，死亡約160萬人，分別占全球癌癥新發(fā)和死亡病例的13％和19％，其中男性明顯高于女性。近年來，我國的肺癌的發(fā)病率也逐年上升，2012年我國男性肺癌的發(fā)病率和死亡率分別為45.9/10萬和42.2/10萬，而女性則分別為19.3/10萬和17.5/10萬，均高于世界平均水平?，F(xiàn)階段研究證實(shí)煙草暴露是肺癌最主要的環(huán)境危險(xiǎn)因

2、素。中國是煙草的生產(chǎn)和消費(fèi)大國，全世界約30％的煙草由中國生產(chǎn)。據(jù)WHO估計(jì)，中國在2025年因肺癌去世的人數(shù)將達(dá)到100萬人。肺癌類型較多，基于肺癌的生物學(xué)特征、治療和預(yù)后等方面的差異，主要將其分為兩大類:非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)。其中非小細(xì)胞肺癌更為常見，占所有肺癌病例的85％以上，非小細(xì)胞肺癌又可分為非鱗狀

3、細(xì)胞癌（包括腺癌、大細(xì)胞癌和其他細(xì)胞類型）和鱗狀細(xì)胞癌（表皮樣）癌，其中又以非鱗狀細(xì)胞癌中的腺癌最為常見，也是非吸煙患者中發(fā)病率最高的病理類型。治療肺癌一般有3種常規(guī)手段，即手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療。近年來，也陸續(xù)出現(xiàn)一些特異的分子靶向治療的藥物，可用于部分不能手術(shù)切除的、晚期、復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移的NSCLC患者。
　　癌/睪丸蛋白質(zhì)(Cancer/Testis protein，CT protein)是一類在睪丸中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，且可以在

4、癌癥組織中異常激活的一類蛋白。自1991年Van der Bruggen等從黑色素瘤細(xì)胞中分離鑒定了第一個(gè)CT蛋白----黑色素瘤相關(guān)抗原1(MAGE1)以來，它們就被認(rèn)為是重要的候選腫瘤治療疫苗，其治療作用已在不同階段的臨床試驗(yàn)中有所體現(xiàn)，并且未見明顯副反應(yīng)，所以既往大多數(shù)研究的焦點(diǎn)主要集中在CT基因在腫瘤免疫治療中的作用。然而，CT基因的表達(dá)特性決定了這類基因不僅可用于腫瘤的免疫治療，還可在靶向治療中發(fā)揮作用。腫瘤靶向治療中CT的作

5、用也逐漸受到重視，腫瘤的靶向治療也是過去幾十年來癌癥研究的重大進(jìn)展之一。現(xiàn)階段已有約250個(gè)CT基因或基因家族被鑒定出來，收錄于CT數(shù)據(jù)庫。CT基因在腫瘤中的表達(dá)存在異質(zhì)性，約在40％的惡性腫瘤中有不同程度的異常表達(dá)，并且在同一種癌癥的不同亞型中，表達(dá)也可能出現(xiàn)差異，提示其可能參與部分特定癌癥或其亞型的發(fā)生發(fā)展。研究顯示CT基因參與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等過程，與癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，影響癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的拮抗等生物學(xué)特征。因此

6、，CT基因可能在細(xì)胞癌變和腫瘤轉(zhuǎn)移等多個(gè)方面發(fā)揮作用。PIWIL1基因最早在睪丸cDNA文庫中被鑒定出來，提示其有著影響哺乳動(dòng)物精子發(fā)生的潛在功能。PIWIL1除了在睪丸中有較高的表達(dá)，具有干細(xì)胞自我更新能力以外，在多種惡性實(shí)體腫瘤中都有表達(dá)，比如乳腺癌、結(jié)直腸癌和食管癌等。另有研究顯示PIWIL1的表達(dá)與多種腫瘤的分型、分期和預(yù)后有關(guān)，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。在肺癌干細(xì)胞中沉默PIWIL1的表達(dá)后，可以降低細(xì)胞增殖能力

7、和促進(jìn)細(xì)胞凋亡;在裸鼠皮下瘤中注射PIWIL1相關(guān)的shRNA后，腫瘤生長受限，腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，且在多種腫瘤的研究中都得到證實(shí)。以往的研究還顯示Piwi蛋白家族成員能夠影響miRNA系統(tǒng)發(fā)揮作用，在一定程度上影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　目前，對(duì)于PIWIL1在肺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，PIWIL1在正常組織中表現(xiàn)出睪丸優(yōu)勢(shì)表達(dá)的特征。在肺癌病例中也有表達(dá)，在肺腺癌和肺鱗癌中表達(dá)比例分別為33.5％和23

8、.5％;對(duì)肺腺癌和肺鱗癌進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)PIWIL1在肺腺癌中表達(dá)明顯高于肺鱗癌，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;進(jìn)一步對(duì)肺癌病例的年齡、性別、吸煙和TNM分期進(jìn)行分組比較，發(fā)現(xiàn)在這些分組中，PIWIL1的表達(dá)水平均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究還分別在肺腺癌病例和肺鱗癌病例中分析PIWIL1表達(dá)水平與該基因DNA序列前2kb的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平的關(guān)系，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在PIWIL1表達(dá)高的病例中甲基化水平低，且肺腺癌和肺鱗癌中結(jié)果一致。用BSP

9、方法驗(yàn)證結(jié)果也顯示在PIWIL1高表達(dá)的樣本中甲基化水平要較低。通過分析高表達(dá)PIWIL1的肺癌組織和不表達(dá)的癌旁組織中miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在兩對(duì)樣本中同時(shí)上調(diào)的miRNA有44個(gè)，下調(diào)12個(gè)，且上調(diào)和下調(diào)的top10的miRNA均有研究顯示與腫瘤相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了PIWIL1的表達(dá)在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的功能學(xué)作用。利用慢病毒包裝的PIWIL1載體GV358-PIWIL1+轉(zhuǎn)染A549(A549-PIWIL1+)和小干擾

10、RNA(siPIWIL1)轉(zhuǎn)染H1299(H1299-siPIWIL1)，分別上調(diào)和下調(diào)肺癌細(xì)胞中PIWIL1的表達(dá)，CCK8和EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)PIWIL1表達(dá)高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示PIWIL1表達(dá)高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng);檢測(cè)PIWIL1表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型的影響，在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PIWIL1高表達(dá)使A549侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，而在PIWIL1表達(dá)下調(diào)的H1299中，細(xì)胞的侵襲和

11、轉(zhuǎn)移能力減弱。
　　本研究通過獲取公共數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)信息，分析PIWIL1在乳腺癌、膀胱癌、腎癌以及頭頸部癌中的表達(dá)以及與甲基化水平的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)PIWIL1在癌癥中所發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示PIWIL1在19.7％的乳腺癌，24.7％的膀胱癌，60.3％的腎癌和38.5％的頭頸部腫瘤中有表達(dá);進(jìn)一步分析PIWIL1表達(dá)與甲基化水平的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在四種腫瘤中，PIWIL1表達(dá)高的病例中甲基化水平均較低，表達(dá)水平與甲基化水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)