版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、血小板是哺乳動(dòng)物血液中的重要細(xì)胞成分之一,主要起凝血作用。大量的研究數(shù)據(jù)表明,血小板生成素(TPO)是血小板形成過程中一個(gè)最重要的細(xì)胞因子。但有研究結(jié)果顯示TPO并不是必不可缺,在TPO基因敲除小鼠中,巨核細(xì)胞和血小板減少85%,但小鼠仍然正常發(fā)育,這提示還有其它的代償機(jī)制,或有未發(fā)現(xiàn)的其他配體蛋白在血小板缺失的情況下替代TPO的作用。本實(shí)驗(yàn)室曾用血小板生成素受體胞外區(qū)域(Mpl-EC)為釣餌,從人體胎兒肝臟cDNA文庫中篩選出與血小板
2、生成素受體(Mpl)互相作用的新配體蛋白—hNUDC(humannuclear distribution protein C,hNUDC)。通常認(rèn)為,NUDC在哺乳動(dòng)物細(xì)胞僅行使核遷移的功能,但是本實(shí)驗(yàn)室前期的結(jié)果表明,hNUDC與Mpl有較強(qiáng)的結(jié)合,并通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀(IP)的研究方法,將TPO、hNUDC兩個(gè)配體與受體Mpl-EC的結(jié)合區(qū)域確定在Mpl-EC-D1(102-251 aa)區(qū)域。
本論文以上
3、述研究為基礎(chǔ),進(jìn)一步深入地研究兩配體TPO或hNUDC與受體Mpl的具體結(jié)合部位。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求,需要純度較高且數(shù)量較大的TPO、hNUDC蛋白質(zhì)作為研究材料。為了滿足實(shí)驗(yàn)的需要,我們分別采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一二氫葉酸還原酶擴(kuò)增系統(tǒng)(CHO-dhfr-)來表達(dá)兩種配體蛋白。通過優(yōu)化一系列誘導(dǎo)表達(dá)條件,成功地表達(dá)了hNUDC,蛋白表量可達(dá)500μg/L,但未能成功表達(dá)TPO蛋白。為此,我們使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
4、——二氫葉酸還原酶擴(kuò)增系統(tǒng)(CHO-dhfr-)來表達(dá)兩種配體蛋白。通過酸鈣法將構(gòu)建好的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pCDNA3.1-TPO-His和pCDNA3.1-TS-hNUDC-His,分別與pSV2-dhfr載體共轉(zhuǎn)染到二氫葉酸還原酶缺陷型細(xì)胞系(CHO-dhfr-)。經(jīng)過G418抗性及培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷篩選,得到了能夠高效分泌表達(dá)TPO-His蛋白和hNUDC-His的穩(wěn)定系。表達(dá)得到的蛋白采用Ni親和層析一步法純化,純度可達(dá)95%以上
5、。BCA法測定兩種配體蛋白的濃度,并估算其表達(dá)量,TPO-His為2.8μg/106cells/24h,hNUDC-His為1.5μg/106cells/24h。
了進(jìn)一步定位Mpl-EC(102-251 aa)與兩配體TPO或hNUDC結(jié)合的最小區(qū)段,先以EBP晶體結(jié)構(gòu)為模板,模建得到Mpl-EC-Dl的3D結(jié)構(gòu)。再根據(jù)受體3D結(jié)構(gòu)模型,將Mpl-EC-D1(102-251 aa)分成5小段,并將其cDNA分別克隆到噬菌
6、體載體中,最終以噬菌體衣殼蛋白的形式展示在噬菌體表面。然后分別用ELISA篩選能與兩配體有效結(jié)合的噬菌體。結(jié)果,Mpl-EC-D1(206-251 aa)區(qū)段是TPO和hNUDC共同的有效結(jié)合微區(qū)域。為進(jìn)一步闡明兩配體與受體結(jié)合的具體氨基酸位點(diǎn)。通過一系列丙氨酸置換突變的工作,突變了15個(gè)相關(guān)氨基酸位點(diǎn),通過噬菌體ELISA結(jié)合分析,得到位于Mpl-EC-D1(206-251 aa)兩個(gè)疏水性氨基酸Lue-228和Lue-230對hNU
7、DC與受體的結(jié)合有重要作用;而Asp-235和Leu-239對TPO與受體的結(jié)合起關(guān)鍵作用。另外,為了證明WGSWS保守序列與TPO或hNUDC結(jié)合是否有關(guān),本論文將WGSWS進(jìn)行缺失突變后,分別于兩配體進(jìn)行了結(jié)合實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,和野生型相比較,缺失突變WGSWS的受體與hNUDC結(jié)合下降19%,而該突變對TPO與受體的結(jié)合影響并不顯著。
總之,本論文利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(CHO-dhfr-)成功篩選得到高效分泌表達(dá)TPO
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 血小板生成素受體(Mpl)與其新配體hNUDC相互依賴關(guān)系及其功能研究.pdf
- 血小板生成素受體(Mp1)胞外區(qū)與XP1的相互作用.pdf
- 血小板生成素受體c-Mpl與相關(guān)蛋白作用機(jī)制的研究.pdf
- 血小板生成素受體及其新配體hNUDC的可溶性表達(dá)與純化.pdf
- 促血小板生成素(TPO)的心臟保護(hù)作用研究.pdf
- 促血小板生成素(TPO)在體外對小劑量ADP誘導(dǎo)的血小板活化功能的影響.pdf
- 重組血小板生成素對骨髓抑制小鼠的促血小板生成作用.pdf
- NUDC與血小板生成素受體之間相互作用及其活性的研究.pdf
- 血小板生成素與血小板和巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)的相關(guān)性研究.pdf
- 血管生成素與血小板可能關(guān)系的探索.pdf
- 3339.普魯蘭酶糖結(jié)合關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的功能研究
- 血小板生成素對膿毒癥血小板減少小鼠的作用研究.pdf
- 促血小板生成素(TPO)對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用研究.pdf
- 血小板生成素受體激動(dòng)劑對慢性ITP FcγRs的調(diào)控研究.pdf
- 重組人血小板生成素治療NSCLC化療后血小板減少的臨床效應(yīng).pdf
- 重組人血小板生成素對膿毒癥血小板減少癥小鼠血管生成素血漿水平和肺組織凋亡的影響
- 人血小板生成素基因表達(dá)和調(diào)控的初步研究.pdf
- Ⅰ 人血小板生成素受體c-Mpl信號傳導(dǎo)途徑研究;Ⅱ ADAM19相互作用蛋白質(zhì)初步探討.pdf
- Rituximab單藥與聯(lián)合血小板生成素治療免疫性血小板減少癥對照研究.pdf
- 重組人血小板生成素治療免疫性血小板減少癥的系統(tǒng)評價(jià).pdf
評論
0/150
提交評論