血小板因子-4與Neuropilin-1（NRP1）相互作用位點的鑒定.pdf

1、背景：Neuropilin-l(NRP1)是細胞表面相對分子量(Mr)為102,000Da的Ⅰ型跨膜糖蛋白，通過雜交瘤技術(shù)在歐洲蟾蜍的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)。進一步研究證明NRP1通常表達在內(nèi)皮細胞及一些腫瘤細胞，是Semaphorin3A(Sema3A)和血管內(nèi)皮生長因子165(vascular endothelial growth factor 165，VEGFl65)的受體，在神經(jīng)軸突的生長、血管的生成、發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要的作

2、用。最近有研究表明NRP1在原始T細胞與dendritic　cell(DCs)穩(wěn)定接觸中起重要作用，是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞持續(xù)的表面標志之一，不依賴于Treg細胞是否活化，在免疫反應的起始上扮演著重要角色。本課題組的前期研究已顯示血小板因子-4(Platelet Faetor-4/PF4，又名CXCL4)可以刺激CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞的增殖，并與NRP1結(jié)合,同時在PF4刺激Treg細胞增殖過程中NRP1表

3、達量增加，故推測NRP1在PF4刺激Tr增殖過程中發(fā)揮受體或共受體的作用。本研究為了進一步確定NRP1與PF4作用的結(jié)合位點或功能域，為Tr細胞的功能及其調(diào)控提供分子依據(jù)，并具有應用于治療自身免疫性疾病的前景。 方法及結(jié)果：NRP1在脊椎動物中高度保守，由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)三部分組成，其中胞外段包括860個氨基酸，由3個不同的結(jié)構(gòu)域組成，分別稱為a1/a2、b1/b2和c。其中a1/a2又稱CUB結(jié)構(gòu)域(complement

4、-binding protein homology)，b1/b2結(jié)構(gòu)域與凝血因子V和Ⅷ結(jié)構(gòu)相似同源，在C結(jié)構(gòu)域的中部含有MAM結(jié)構(gòu)域(meprin，A5，μ)。NRP1的胞外段各個區(qū)能和不同的分子結(jié)合介導不同的信號傳導，Sema3A通過a1/a2/b1區(qū)與NRP1結(jié)合，VEGF165能與NRP1的b1/b2區(qū)結(jié)合，Heparin亦通過b1/b2區(qū)與NRP1結(jié)合，所以NRP1具有多種功能[6]。根據(jù)NRP1的結(jié)構(gòu)特點，本實驗采用原核表達的

5、方式分段表達NRP1的a1/a2(CUB)、b1/b2(F5/8C)、MAM三個結(jié)構(gòu)域，分別得到融合蛋白后，免疫Balb/c鼠后，通過細胞融合制備單克隆抗體并對所制備抗體進行初步鑒定，鑒定后的抗體再與PF4做作用位點的篩選。 首先，搜索NRP1的蛋白序列(HumanProteinReference　Database，www.hprd.org)，分段截取NRP1的3個domain(CUB、F5/8C、MAM)，從人單核細胞cDNA

6、中擴增出3個片段基因。原核表達選擇pGEX-5X-1載體作為表達載體，根據(jù)載體的酶切圖譜設(shè)計引物，將NRP1的3個domain基因序列分別插入到pGEX-5X-1載體的EcoRI和NotI兩個限制性酶切位點之間，PCR反應后，得到目的條帶；將擴增的目的片段從膠上回收后，進行T載體的連接；轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒后雙酶切，再與同時雙酶切的表達載體pGEX-5X-1載體進行連接，然后再轉(zhuǎn)化，各挑取兩個陽性克隆，搖菌后，進行測序鑒定。將測序鑒定正確的表

7、達載體轉(zhuǎn)化入BL21菌株后誘導表達，獲得正確表達的目的蛋白并純化。 其次，將純化的GST-CUB、GST-F5/8C、GST-MAM融合蛋白與等體積福氏完全佐劑進行充分乳化，對Balb/c小鼠進行多點皮下注射。首次免疫后4周加強免疫一次，免疫原用量減為首免的一半，并與福氏不完全佐劑充分乳化。兩周后ELISA法檢測效價，效價在1:8000以上的小鼠即可進行加強免疫，加強免疫四天后進行細胞融合，ELISA法篩選能夠穩(wěn)定分泌抗CUB

8、、F5/8C、MAM mAb的陽性克隆，并亞克隆，分別獲得能夠穩(wěn)定分泌CUB單克隆抗體的細胞系6株，分泌F5/8C單克隆抗體的細胞系5株，分泌MAM單克隆抗體的細胞系2株。 第三，用GST標簽蛋白通過Western blot對所獲單克隆抗體進行鑒定，其中不識別GST標簽蛋白而只識別融合蛋白的細胞株為識別目的蛋白的陽性株。結(jié)果顯示，識別CUB蛋白的陽性株：UAH058、UDC114、UDG054、UBB067、UCB064，識別

9、F5/8C的陽性株：OCA084、OEG082，無識別MAM的陽性株。用ELISA法分別檢測PF4與CUB、F5/8C的相互作用，結(jié)果為：PF4與F5/8C存在特異的分子間相互作用。 結(jié)論：成功獲得的NRP1三個片段CUB、F5/8C、MAM的鼠抗人單克隆抗體的可應用于蛋白結(jié)構(gòu)、定位、功能等常規(guī)的生命科學研究外，在臨床診斷和治療方面也具有重要的意義，初步證明了PF4可與NRPl的F5/8C區(qū)發(fā)生特異性的結(jié)合，將為今后NRP1分