去整合素金屬蛋白酶ADAM12相互作用蛋白鑒定及功能研究.pdf

1、目的：去整合素金屬蛋白酶（ADAMs）家族是一類(lèi)含有前肽結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域、膜近端上皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域等多個(gè)結(jié)構(gòu)域的鋅離子依賴(lài)的跨膜糖蛋白水解酶，它們參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括蛋白水解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞粘連、遷移等，并與腫瘤的發(fā)生和侵襲密切相關(guān)。人源ADAM12定位于染色體10q26.3，具有典型的ADAM家族蛋白的結(jié)構(gòu)序列?，F(xiàn)有臨床研究發(fā)現(xiàn)ADAM12在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)該水解酶可以水

2、解一些特定的底物蛋白，如 Heparin-binding EGF-like growth factor(HB-EGF)、Delta-like1、Ephrin-A1等。用小分子藥物抑制其水解活性，可以抑制HB-EGF的脫落，使心肌肥大癥狀減緩，這說(shuō)明了ADAM12的水解功能在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要性。但ADAM12是如何調(diào)節(jié)下游蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等問(wèn)題還不清楚。本文以ADAM12為研究對(duì)象，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀高通

3、量篩選在腫瘤細(xì)胞中與ADAM12相互作用的蛋白，并探究這些蛋白與ADAM12的相互調(diào)控關(guān)系。
　　方法：首先構(gòu)建了帶FLAG標(biāo)簽的ADAM12的兩個(gè)亞型 ADAM12-L和ADAM12-S的質(zhì)粒。在人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ADAM12-L和ADAM12-S并收集細(xì)胞提取蛋白，然后用與共價(jià)結(jié)合FLAG抗體的微珠進(jìn)行免疫共沉淀，純化富集并洗脫與ADAM12-L和/或ADAM12-S相互作用的蛋白，再通過(guò)蛋白免疫印跡方法驗(yàn)證蛋白

4、表達(dá)及純化效率。將純化后的蛋白用 SDS-PAGE分離并銀染，找到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有差異的條帶，膠內(nèi)用胰蛋白酶酶解成多肽后，用LC-MS/MS質(zhì)譜分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索獲得與 ADAM12-L和/或 ADAM12-S相互作用的蛋白。通過(guò)生物信息學(xué)方法分析這些蛋白的已知功能，預(yù)測(cè)ADAM12可能參與的生物學(xué)過(guò)程及其生物學(xué)功能。最后通過(guò)生物化學(xué)方法驗(yàn)證這些蛋白與 ADAM12-L和/或 ADAM12-S的相互作用并探究其在腫瘤細(xì)胞中與ADAM1

5、2-L和/或ADAM12-S的相互調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果：在兩次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)質(zhì)譜分析我們共發(fā)現(xiàn)了297個(gè)與ADAM12-L相互作用的蛋白，其中有33個(gè)蛋白在兩次實(shí)驗(yàn)中均存在；同時(shí)，共發(fā)現(xiàn)149個(gè)與ADAM12-S相互作用的蛋白，其中的13個(gè)蛋白在兩次生物學(xué)重復(fù)中均被發(fā)現(xiàn)，在這13個(gè)蛋白里，有11個(gè)與ADAM12-S特異性相互作用。ADAM12的不同亞型有其特異性相互作用的蛋白，預(yù)示著它們不同的功能。生物化學(xué)方法驗(yàn)證了myo

6、ferlin、vimentin和endoplasmin(GRP94)與ADAM12-L或ADAM12-S的相互作用。許多與ADAM12相互作用的蛋白與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。另外，過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ADAM12-L可以上調(diào)其相互作用蛋白 vimentin的表達(dá)，且無(wú)酶活性的突變體ADAM12-L-E351Q也可以上調(diào)vimentin蛋白的表達(dá)，程度與野生型ADAM12-L接近。而myoferlin則可以通過(guò)影響ADAM12-L的穩(wěn)定性，

7、上調(diào)未成熟型的ADAM12-L的表達(dá)并使其降解速度明顯變緩，但對(duì)成熟型的ADAM12-L影響不大；當(dāng)通過(guò)siRNA敲低myoferlin后，兩種形式的ADAM12-L的表達(dá)都有所減少。分子伴侶GRP94則對(duì)ADAM12-S的分泌有著重要的調(diào)節(jié)作用，用siRNA敲低GRP94使其蛋白表達(dá)水平降低后，發(fā)現(xiàn)分泌到培養(yǎng)基中的ADAM12-S明顯減少。
　　結(jié)論：通過(guò)無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量篩選獲得297個(gè)ADAM12-L相互作用的蛋

8、白，149個(gè)與 ADAM12-S相互作用的蛋白，并通過(guò)免疫印跡的方法驗(yàn)證其中的一些蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它們與ADAM12-L或ADAM12-S之間的相互調(diào)控關(guān)系。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ADAM12-L很有可能是連接腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的蛋白 myoferlin和vimentin的關(guān)鍵蛋白，同時(shí)也揭示了ADAM12-L的非酶活性功能。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)我們研究ADAM12-L在腫瘤細(xì)胞中參與的信號(hào)通路，揭示其調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機(jī)制等有很大的幫助。