去整合素金屬蛋白酶33在哮喘中的作用及其與干擾素γ的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景: 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。全世界大約有3億哮喘患者，所有哮喘患者包括兒童在內(nèi)，都存在氣道重塑，氣道重塑的發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)之前就已經(jīng)存在。主要表現(xiàn)為上皮下纖維化，包括氣道平滑肌細(xì)胞增生和肥大、氣道壁血管的增生，以及粘液分泌增加。引起哮喘患者氣道重塑的原因尚不十分清楚。目前針對哮喘的治療主要分為控制發(fā)作用藥和急救用藥，尚沒有藥物可以逆轉(zhuǎn)哮喘患者的氣道重塑。 去整合素金

2、屬蛋白酶(ADAM)33是最近發(fā)現(xiàn)的ADAM家族成員，定位于第20號染色體短臂13號位(20p13)，編碼一種金屬蛋白酶，可能參與氣道的重塑。ADAM33是一個(gè)高度多態(tài)性的基因，含有70多個(gè)單核苷酸多肽位點(diǎn)。其中許多位點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)與氣道高反應(yīng)性和哮喘有關(guān)。ADAM33主要在平滑肌細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達(dá)，而在上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或炎癥細(xì)胞中表達(dá)較少。ADAM33在間充質(zhì)細(xì)胞中的選擇性表達(dá)，說明其活性改變可能會導(dǎo)致氣道平滑肌細(xì)

3、胞和成纖維細(xì)胞的功能異常，因此推測ADAM33可能與氣道重塑有關(guān)。ADAM33在慢性哮喘模型中的作用，目前尚無相關(guān)報(bào)道。 哮喘是一種以Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)失衡為特點(diǎn)的氣道變應(yīng)性炎癥性疾病，表現(xiàn)為Th2反應(yīng)增強(qiáng)，Th1反應(yīng)減弱。干擾素-γ(IFN-γ)是Th1型細(xì)胞因子，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用：主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈抑制Th2細(xì)胞因子(IL-4，IL-13)的活性，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡；在哮喘患者的肺泡灌洗液(BALF)中，

4、：IFN-γ的水平明顯低于正常人：IFN-γ可以明顯減輕哮喘模型的氣道高反應(yīng)性。 IFN-γ也參與了肺部疾病氣道重塑。IFN-γ可以減輕病毒性細(xì)支氣管炎導(dǎo)致的氣道炎癥、氣道重塑和肺阻力及動態(tài)順應(yīng)性的改變；在博來霉素所致的肺纖維化小鼠模型中，IFN-γ可以明顯抑制成纖維細(xì)胞的增生和膠原沉積；在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化患者中，給予IFN-γ治療可以降低IFN-β1和結(jié)締組織生長因子基因的表達(dá)水平，從而提高患者的肺功能和血?dú)馑健Ｈ欢诼?/p>

5、哮喘模型中，IFN-γ與氣道重塑的關(guān)系報(bào)道甚少。 在過敏源所致的急性哮喘模型中，針對一種或多種細(xì)胞因子，已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，并且取得了良好的效果。但是應(yīng)用于臨床后的結(jié)果卻令人大失所望。試驗(yàn)與臨床不一致的原因可能是由于，人類哮喘是一種慢性疾病，而動物模型是一種短期激發(fā)所導(dǎo)致的急性模型或者是基因敲除所致的某種細(xì)胞因子缺乏的模型。因此，若要評價(jià)一種干預(yù)方案是否可靠，必須建立與人類疾病更為相似的慢性氣道疾病模型。 本研究構(gòu)建了

6、小鼠慢性氣道重塑哮喘模型，以重組小鼠IFN-γ（rm IFN-γ)和腺病毒載體介導(dǎo)小鼠IFN-γ(AdCMVmIFN-γ)干預(yù)，觀察其在體內(nèi)對ADAM33表達(dá)的及氣道重塑的影響。在體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞系中，給予rmIFN-γ和AdCMVmIFN-γ干預(yù)，觀察其直接對ADAM33表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；同時(shí)，為進(jìn)一步研究ADAM33基因的功能，本實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建了ADAM33-短發(fā)卡RNA(shRNA)慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體，成功敲低了成纖維細(xì)胞中AD

7、AM33基因的表達(dá)，為下一步構(gòu)建ADAM33基因敲低試驗(yàn)動物，進(jìn)一步探索ADAM33基因在哮喘中的作用提供了有力的工具。 第一章干擾素Y對小鼠哮喘模型去整合素金屬蛋白酶33的調(diào)節(jié)作用 目的:探討預(yù)防性和治療性給予腺病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)小鼠γ干擾素(AdCMVmIFN-γ)和重組mIFN-γ(rmIFN-γ)在卵蛋白所致小鼠氣道重塑哮喘模型中對ADAM33表達(dá)及氣道重塑的影響。 方法:C57BL/6小鼠于第0、1

8、4天以卵蛋白(Ovalbumin，OVA)腹腔注射致敏，從第24天開始霧化吸入2.5％的OVA激發(fā)并持續(xù)18天，建立氣道重塑模型。分別預(yù)防性給予(抗原激發(fā)前一天)和治療性給予(第一次抗原激發(fā)后18天)AdCMVmIFN-γ和rmIFN-γ。用半定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白免疫印跡法檢測ADAM33的表達(dá)，同時(shí)對肺組織切片行蘇木精一依紅(HE)和Masson染色，測定氣道平滑肌厚度和膠原面積。 結(jié)果:OVA致敏/激發(fā)的小鼠模型

9、肺組織中呈明顯以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性浸潤、平滑肌肥厚、膠原沉積和ADAM33高表達(dá)。預(yù)防性給予AdCMVmIFN-γ轉(zhuǎn)基因表達(dá)mIFN-γ可明顯改善上述變化。而在氣道重塑形成后治療性給予AdCMVmIFN-γ轉(zhuǎn)基因表達(dá)mIFN-γ干預(yù)和rmIFN-γ可部分下調(diào)ADAM33表達(dá)和氣道重塑發(fā)生。 結(jié)論:ADAM33在哮喘平滑肌肥厚和膠原沉積過程中可能起一定作用；腺病毒介導(dǎo)mIFN-γ道內(nèi)局部轉(zhuǎn)基因表達(dá)的預(yù)防性干預(yù)可明顯抑制ADAM

10、33的表達(dá)，減輕氣道重塑；氣道重塑形成后的治療性干預(yù)可部分下調(diào)ADAM33表達(dá)和減輕氣道重塑。 第二章干擾素γ對小鼠成纖維細(xì)胞中ADAM33的調(diào)節(jié)作用 目的:探討IFN吖在小鼠成纖維細(xì)胞系(NIH/3T3)AD對ADAM33基因表達(dá)的影響。 方法:以不同濃度的腺病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)小鼠γ干擾素(AdCMVmIFN-γ)和重組組mIFN-γ(rmIFN-γ)在不同時(shí)間干預(yù)NIH/3T3細(xì)胞系，采用ELISA方法檢

11、測細(xì)胞培養(yǎng)液中mIFN-γ的含量，以RT-PCT和Western-Blot方法檢測細(xì)胞中ADAM33mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。 結(jié)果:AdCMVmIFN-γ轉(zhuǎn)基因表達(dá)mIFN-γ和rmIFN-γ均呈濃度和時(shí)間依賴模式抑制ADAM33mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。rmIFN-γ組，24-48小時(shí)ADAM33 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平開始逐漸恢復(fù)；AdCMVIFN-γ轉(zhuǎn)基因表達(dá)mIFN-γ對ADAM33 mRNA和蛋白質(zhì)的抑制可以

12、持續(xù)到96小時(shí)。 結(jié)論:IFN-γ可以以時(shí)間依賴模式和濃度依賴模式抑制NIH/3T3細(xì)胞系中ADAM33的表達(dá)；AdCMVmIFN-γ轉(zhuǎn)基因表達(dá)mIFN-γ較rIFN-γ的作用時(shí)間更長。 第三章應(yīng)用短發(fā)卡RNA慢病毒質(zhì)粒載體抑制去整合素金屬蛋白酶33表達(dá) 目的:針對不同靶點(diǎn)的ADAM33 DNA基因組，在不同區(qū)域構(gòu)建shRNA慢病毒真核表達(dá)載體，篩選出ADAM33特異、高效的shRNA片段，抑制ADAM33基因的

13、表達(dá)。 方法:分別在ADAM33基因的前體結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶域和跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)，設(shè)計(jì)4對不同靶點(diǎn)的特異性shRNA序列，構(gòu)建相應(yīng)的真核表達(dá)載體(pGCL-GFP shRNAl、2、3、4)。分別將這4種質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入小鼠成纖維細(xì)胞3T3中。在轉(zhuǎn)染后24、48和72小時(shí)分別采用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率、半定量RT-PCR和免疫印跡的方法檢測細(xì)胞中ADAM33基因及蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)，其插入序列與目的

14、序列完全一致，說明重組載體構(gòu)建成功。與對照組相比，pGCL-GFP shRNA3轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，對ADAM33基因和蛋白表達(dá)的干擾效果明顯，分別達(dá)49.3±2.52％和30.1±5.51％。而1、2和4號載體干擾效果相對較弱。 結(jié)論:本研究建立了ADAM33 pGCL-GFP shRNA慢病毒質(zhì)粒載體，成功干擾了ADAM33基因和蛋白的表達(dá)，為下一步制備ADAM33基因敲降的實(shí)驗(yàn)動物，研究ADAM33在哮喘發(fā)病中的作用提供了有力