基質(zhì)金屬蛋白酶8在血管生成中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 血管生成(Angiogenesis)是指在已有微血管基礎(chǔ)上形成以毛細(xì)血管為主的新生血管系統(tǒng)，其主要步驟包括血管基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解;內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖;管狀結(jié)構(gòu)形成;平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的附著等。血管生成在胚胎發(fā)育、女性子宮內(nèi)膜血管重建及組織損傷修復(fù)等生理過(guò)程中起到重要作用。在某些病理?xiàng)l件下，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、銀屑病及腫瘤等，血管生成也被證明起到關(guān)鍵作用。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(Ma

2、trixmetalloproteinases，MMPs)是一類(lèi)鋅離子依賴(lài)性的蛋白內(nèi)切酶，于1962年由Gross在蛙尾實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)20余種。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MMPs是除內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子之外的另一類(lèi)與血管生成密切相關(guān)的一個(gè)蛋白家族，能調(diào)控多種生理及病理?xiàng)l件下的血管生成。MMP14基因敲除能造成小鼠胚胎血管生成的重大缺陷。MMP13基因敲除能抑制小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合時(shí)的血管生成。MMP7能誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加裸鼠異種異

3、位移植腫瘤內(nèi)的血管生成。一些基質(zhì)金屬蛋白酶也被證明在血管生成中起到抑制作用，如MMP12、MMP27。人們對(duì)MMPs調(diào)控血管生成的機(jī)制也做了大量的研究，目前認(rèn)為，MMPs主要通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及促血管生成因子或血管生成抑制因子的表達(dá)及釋放來(lái)調(diào)控體內(nèi)、體外血管生成。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP8），又稱(chēng)中性粒細(xì)胞膠原酶，最早在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均表達(dá)MM

4、P8。MMP8在多種細(xì)胞的增殖和遷移中起到重要作用。MMP8能促進(jìn)小鼠中性粒細(xì)胞在角膜基質(zhì)中的遷移，促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞表面的遷移，增加小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。但是有關(guān)MMP8在內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及體內(nèi)、體外血管生成過(guò)程中的作用尚無(wú)報(bào)道。
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，已成為造成人類(lèi)死亡的首位原因。越來(lái)越多的研究表明，斑塊內(nèi)血管生成與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān)。斑塊內(nèi)新生血管可見(jiàn)于動(dòng)

5、脈粥樣硬化病程中的各個(gè)時(shí)期，且病變?cè)街?，斑塊內(nèi)新生血管越豐富。這些新生血管一方面能增加斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)紅細(xì)胞來(lái)源的膽固醇在脂核中沉積，加重炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)粥樣斑塊的快速進(jìn)展;另一方面，斑塊內(nèi)新生血管缺乏細(xì)胞外基質(zhì)和平滑肌細(xì)胞的支持，較正常血管脆性高，易導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血、破裂，引發(fā)嚴(yán)重的急性臨床事件如急性心肌梗死、腦卒中等，危及病人生命。
　　 已有研究表明，MMP8在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)有表達(dá)，且在快速進(jìn)展的頸動(dòng)脈粥樣

6、斑塊中表達(dá)增加。又有研究證明，MMP8基因敲除能抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的炎癥反應(yīng)，說(shuō)明MMP8參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，但MMP8對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的作用是否與斑塊內(nèi)血管生成有關(guān)，亦無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　 目的:
　　 1.探討MMP8在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及體外血管生成中的作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　 2.利用動(dòng)物模型探討MMP8在體內(nèi)血管生成中的作用。
　　 3.利用apoE/MMP8雙基因敲除小鼠（apoE-

7、/-/MMP8-/-）和對(duì)照組小鼠(apoE-/-/MMP8+/+)小鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，觀察MMP8對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊內(nèi)血管生成的影響。
　　 方法:
　　 1.利用編碼MMP8shRNA(shorthairpinRNA，shRNA)的病毒載體和編碼非靶向shRNA(NontargetshRNA)的病毒載體分別感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVE

8、Cs)。完成藥物篩選后，以MMP8shRNA組HUVECs和NontargetshRNA組HUVECs為研究對(duì)象，用羅氏公司Brdu檢測(cè)試劑盒和Ki67免疫熒光染色檢測(cè)兩組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;用劃痕實(shí)驗(yàn)(Woundscratchassay)測(cè)量?jī)山M內(nèi)皮細(xì)胞的遷移距離;用體外基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)(In-vitroMatrigeltubeformationassay)計(jì)算兩組內(nèi)皮細(xì)胞的成管數(shù)、成管長(zhǎng)度及分支點(diǎn)數(shù)。提取總蛋白，用WesternBlot檢

9、測(cè)兩組內(nèi)皮細(xì)胞MMP8、CD31、β-catenin的表達(dá)。提取核蛋白和胞漿蛋白，用Westernblot檢測(cè)兩組內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin在胞核和胞漿的水平。利用細(xì)胞免疫熒光染色，觀察兩組內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin在胞核和胞漿的分布;用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩組內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin目的基因的表達(dá)情況。使用血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)和血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)分別刺激兩組內(nèi)皮細(xì)胞，Wes

10、ternblot檢測(cè)兩組內(nèi)皮細(xì)胞CD31的表達(dá)。
　　 2.建立兩套基質(zhì)膠栓(Matrigelplug)血管生成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，評(píng)估MMP8在體內(nèi)對(duì)血管生成的影響。在第一套基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)中，將MMP8shRNA組和NontargetshRNA組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用PKH26紅色熒光物質(zhì)標(biāo)記，然后分別與基質(zhì)膠混勻，并注射于兩組apoE-/-/MMP8-/-小鼠皮下。在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)兩組基質(zhì)膠栓切片中PKH26熒光標(biāo)記細(xì)胞，以判斷外源性臍

11、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠體內(nèi)的存活情況：用HE染色，計(jì)算基質(zhì)膠栓中微血管密度及毛細(xì)血管密度，以評(píng)估兩組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠體內(nèi)的血管生成情況。在第二套基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)中，將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VascularEndothelialGrowthFactor165，VEGF165)與基質(zhì)膠混合，然后分別注射于apoE-/-/MMP8+/+組小鼠和apoE-/-/MMP8-/-組小鼠皮下。

12、用免疫雙標(biāo)熒光染色，計(jì)數(shù)基質(zhì)膠栓中CD144陽(yáng)性細(xì)胞和Ki67/CD144雙陽(yáng)性細(xì)胞，以評(píng)估兩組小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠栓中遷移和增殖情況。通過(guò)HE染色，計(jì)算基質(zhì)膠栓中的微血管密度，以評(píng)估兩組小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠栓中的血管生成情況。
　　 3.分別留取人胸主動(dòng)脈瘤和冠狀動(dòng)脈的標(biāo)本，制作成石蠟切片，利用免疫組織化學(xué)染色觀察MMP8在兩組臨床標(biāo)本粥樣斑塊內(nèi)微血管的表達(dá)情況。分別給予apoE-/-/MMP8+/+組小鼠和apo

13、E-/-/MMP8-/-組小鼠高脂飲食12周，建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈模型。使用油紅0染色，測(cè)量?jī)山M小鼠主動(dòng)脈根部粥樣斑塊面積及主動(dòng)脈縱剖面粥樣斑塊面積指數(shù)，以探討MMP8在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中的作用;通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，測(cè)量?jī)山M小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)CD31、CD144陽(yáng)性染色面積和陽(yáng)性顆粒數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性染色面積比例（陽(yáng)性染色面積/粥樣斑塊面積）和陽(yáng)性顆粒密度（陽(yáng)性顆粒數(shù)/粥樣斑塊面積），以評(píng)價(jià)MMP8基因敲除對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)血管

14、生成的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.未進(jìn)行病毒感染的內(nèi)皮細(xì)胞在嘌呤霉素作用24h后全部死亡。MMP8shRNA組內(nèi)皮細(xì)胞和NontargetshRNA組內(nèi)皮細(xì)胞在嘌呤霉素作用24h后仍有大量細(xì)胞存活。藥物篩選10天后，兩組細(xì)胞均表現(xiàn)良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。MMP8shRNA組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、成管數(shù)、成管長(zhǎng)度及分支點(diǎn)數(shù)均較NontargetshRNA組顯著減弱(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，MMP8shR

15、NA組內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白中MMP8、CD31的表達(dá)量較NontargetshRNA組顯著下降（P＜0.05）;MMP8shRNA組內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin的表達(dá)較NontargetshRNA組雖有輕度下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提取兩組內(nèi)皮細(xì)胞核蛋白及胞漿蛋白，Westernblot結(jié)果顯示MMP8shRNA組內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的水平較NontargetshRNA組明顯減少（P＜0.05）。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也進(jìn)一步證

16、實(shí)，MMP8表達(dá)下調(diào)能減少β-catenin在內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)的分布。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示MMP8shRNA組內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin目標(biāo)基因TCF1B、TCF1E、FZD7和CCND1的mRNA水平均較NontargetshRNA組明顯降低（P＜0.05)。10nM血管緊張素Ⅱ作用6h、16h、24h后，兩組內(nèi)皮細(xì)胞CD31的表達(dá)在以上時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)（P＜0.05)。10nM血管緊張素Ⅰ作用24h后，NontargetshRNA組內(nèi)

17、皮細(xì)胞CD31的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05)，而MMP8shRNA組內(nèi)皮細(xì)胞CD31的表達(dá)無(wú)顯著變化(P＞0.05)。
　　 2.在第一套基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)中，兩組基質(zhì)膠栓中PKH26陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均達(dá)到總細(xì)胞數(shù)的90％以上，說(shuō)明兩組外源性臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可以存活，且存活率相對(duì)較高。MMP8shRNA組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在apoE-/-/MMP8-/-小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠栓中形成的微血管密度和毛細(xì)血管密度均較NontargetshRNA組臍

18、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞顯著減少（P＜0.05)。在第二套基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)中，apoE-/-/MMP8-/-小鼠基質(zhì)膠栓中微血管密度、CD144陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、內(nèi)皮細(xì)胞的Ki67陽(yáng)性比例均較apoE-/-/MMP8+/+小鼠組明顯減少（P＜0.05)。
　　 3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示人胸主動(dòng)脈瘤和冠狀動(dòng)脈的粥樣斑塊區(qū)含有較多微血管，且微血管的管壁和管腔面均表達(dá)大量MMP8。apoE-/-/MMP8-/-和apoE-/-/MMP8+/+兩組小鼠接

19、受高脂飲食12周后，油紅0染色結(jié)果顯示apoE-/-/MMP8-/-小鼠主動(dòng)脈根部粥樣斑塊面積和主動(dòng)脈縱剖面粥樣斑塊面積指數(shù)均較apoE-/-/MMP8+/+小鼠明顯減少（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色顯示apoE-/-/MMP8-/-小鼠粥樣斑塊內(nèi)CD31、CD144的陽(yáng)性染色面積比例和陽(yáng)性顆粒密度均較apoE-/-/MMP8+/+組小鼠顯著減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.MMP8表達(dá)下調(diào)能抑制臍靜脈

20、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及體外血管生成，MMP8的這種作用與AngⅡ/CD31/β-catenin傳導(dǎo)通路相關(guān)。
　　 2.MMP8表達(dá)下調(diào)能抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠栓中的血管生成。MMP8基因敲除能抑制小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠栓中的增殖、遷移及血管生成。
　　 3.MMP8基因敲除能抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展及斑塊內(nèi)血管生成。
　　 本研究從血管生成的體外模型（增殖、遷移、體外成管實(shí)驗(yàn)）、體內(nèi)模型（基質(zhì)膠