基質金屬蛋白酶9在腦皮質發(fā)育障礙中的作用研究.pdf

1、腦皮質發(fā)育障礙(MCDs)是一類以大腦皮層細胞構筑異常為表現(xiàn)的神經系統(tǒng)疾病，是臨床上兒童藥物難治性癲癇的重要病因之一。局灶性皮質發(fā)育不良(FCD)和結節(jié)性硬化(TSC)是MCDs常見的兩種亞型，并且病理學表現(xiàn)非常類似。對FCD的病因研究認為，F(xiàn)CD是一類由胚胎發(fā)育期異常的神經細胞增殖、遷移和分化所致的發(fā)育性疾病。在FCD三種病理亞型中，Ⅱb型FCD(FCDⅡb)具有最典型的病理改變，且與其他類型相比具有臨床癲癇發(fā)作較早、癲癇發(fā)作頻率高、

2、發(fā)作間期短等特點。TSC是一類有TSC1或者FSC2基因突變造成的多系統(tǒng)多器官常染色體顯性遺傳病。據統(tǒng)計，在高達70％的TSC患者中有癲癇發(fā)作，并且常常藥物難以控制。盡管從病因學的角度出發(fā)，F(xiàn)CDⅡb和TSC并不相同。但是，鑒于他們在組織病理學上共同的改變以及臨床表現(xiàn)的相似性，我們自然而然地推測他們在癲癇發(fā)作的病理生理學機制上有著某種共性。此外，最近的遺傳學研究也發(fā)現(xiàn)TSC1基因在FCDⅡb的發(fā)育過程中可能起到重要作用，也在某種程度上支

3、持了我們的猜想。在對FCDⅡb及TSC致癇研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CDⅡb中局部皮質發(fā)育不良區(qū)以及TSC的皮層結節(jié)是癲癇放電灶，但是具體機制仍不明確。
　　 迄今為止，神經遞質受體及離子通道在癲癇發(fā)生中的作用吸引了大多數(shù)學者的眼球，很少有研究關注到細胞外蛋白酶在癲癇發(fā)生中的可能作用。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類具有鋅指結構的分泌性或者細胞膜結合性蛋白水解酶，在胚胎發(fā)育、血管生成、組織重塑等生理過程中發(fā)揮重要的作用。在中樞神經系統(tǒng)中(C

4、NS)，MMPs廣泛地參與到腫瘤生成、炎癥反應、缺血、腦創(chuàng)傷等病理過程?；|金屬蛋白酶9(MMP9)是MMPs家族中最被大家所熟知的一員，正常情況下先以酶原(pro-MMP9)形式分泌到細胞外，然后再被分解成活性酶(act-MMP9)形式發(fā)揮生理功能。近來的研究發(fā)現(xiàn)MMP9在皮層發(fā)育、突觸重塑和學習記憶等生理功能中發(fā)揮重要的作用。鑒于在癲癇發(fā)生的過程中伴隨著神經網絡組織重塑，最近一系列的動物實驗證實MMP9參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。然而，MM

5、P9在MCDs中的具體作用仍有待研究。
　　 為了闡明MMP9在MCDs中的作用及其可能的機制，首先，我們利用半定量RT-PCR、western blot、免疫組織化學技術觀察了MMP9在MCDs亞型(FCDⅡb和TSC)臨床標本中的表達分布情況；其次，我們利用局部冰凍損傷新生大鼠腦皮質建立了一個模擬人類微腦回的MCDs大鼠模型，并且檢測了MMP9蛋白及酶活性在不同發(fā)育期的表達情況；最后，為了直觀的了解MMP9在MCDs中的作用

6、，在課題組前期研究的基礎上，我們進一步研究了MMP9對SVZ區(qū)來源的神經前體細胞(neural precursor cells，NPCs)向微腦回區(qū)遷移的影響。通過這些研究，我們得到以下結果：
　　 一、MMP9在MCDs患者皮質病灶中的表達分布
　　 1.FCDⅡb及TSC皮層致癇灶中MP9的mRNA水平較正常對照皮層(CTX)明顯升高。
　　 2.FCDⅡb，TSC及TLE組中MMP9蛋白的酶原表達水平較CT

7、X明顯增高，而活性酶表達量僅見FCDⅡb及TSC較CTX明顯增高，TLE與CTX無顯著差異。
　　 3.在正常皮層中可檢測到MMP9表達，其表達模式與先前報道的一致：呈弱到中等強度表達于神經元及內皮細胞上，在灰質與白質中偶見膠質細胞表達。
　　 4.FCDⅡb病灶內呈現(xiàn)出強MMP9免疫反應。染色強度評分提示FCDⅡb中MMP9蛋白表達較CTX明顯升高。我們進一步對MMP9的細胞分布表達模式進行了研究，發(fā)現(xiàn)：80％±6.5

8、％的BCs(n=352)強表達MMP9；89±3.3％的DNs(n=573)強表達MMP9；83±4.7％的HNs(n=420)強表達MMP9。同時，膠質細胞也呈現(xiàn)強MMP9免疫反應。免疫熒光雙標結果證實MMP9分別共定位于vimentin(未成熟膠質細胞標志物，常見BCs表達)陽性的BCs(圖1-3 H)NF200(神經元標志物)陽性的DNs、HNs。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，MMP9陽性(MMP9+)的膠質細胞是GFAP+的星形膠質細胞，而

9、非Ibal+的小
　　 膠質細胞。
　　 5.在TSC皮層結節(jié)中，MMP9 IR呈現(xiàn)出與FCDⅡb病灶類似的強反應。染色強度評分提示TSC中MMP9蛋白表達較CTX明顯升高。進一步對MMP9的細胞分布表達模式研究發(fā)現(xiàn)，77％±5.3％的GCs(n=491)和85％±3.6％的DNs(n=627)呈中等到強MMP9IR。先前的研究發(fā)現(xiàn)，GCs是一類分化程度不一的細胞，我們免疫雙標的結果也發(fā)現(xiàn)一些MMP9+GCs呈vimen

10、tin+，而另外一些則是NF200+。進一步的熒光雙標實驗發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)MMP9+膠質細胞是GFAP+的星形膠質細胞，而非小膠質細胞。
　　 二、MMP9在FCD大鼠模型微腦回中蛋白、酶活性及細胞定位研究
　　 1.Western Blotting檢測MMP9蛋白在FCD模型及對照組中可見，目的蛋白大小為92kD的MMP9蛋白在各個時相點均可被檢測出，在P10和P20兩個時相點，F(xiàn)CD組MMP9蛋白表達水平較對照組明顯升高

11、。
　　 2.明膠酶譜法檢測MMP9蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)，在P10和P20兩個時相點，F(xiàn)CD組MMP9蛋白酶活性較對照組明顯升高。
　　 3.P10正常大鼠皮層可觀察到MMP9表達，且主要呈中等強度表達在錐體神經元上。P10 FCD大鼠微腦回區(qū)可觀察到MMP9表達，光密度值分析提示FCD微腦回區(qū)MMP9表達強于正常對照組。進一步的免疫熒光結果提示，微腦回區(qū)表達MMP9的細胞為NeuN陽性的神經元，偶見GFAP陽性的膠質細胞表達

12、MMP9。
　　 4.類似于P10的表達模式，我們觀察到MMP9在P20正常大鼠皮層廣泛表達，且主要呈中等強度表達在錐體神經元上。而在P20 FCD大鼠微腦回區(qū)可觀察到MMP9表達主要呈強表達于錐體神經元上。光密度值分析提示FCD微腦回區(qū)MMP9表達強于正常對照組。進一步的免疫熒光結果提示，微腦回區(qū)表達MMP9的細胞為NeuN陽性的神經元，未探及GFAP陽性的膠質細胞表達MMP9。
　　 三、MMP9對SVZ區(qū)NPCs向

13、微腦回區(qū)遷移的影響
　　 1.我們成功地將增強型綠色熒光蛋白腺病毒表達載體(Ad-eGFP)成功地轉染到了SVZ區(qū)細胞中。并且觀察到，F(xiàn)CD皮層冰凍損傷病灶內可見大量散在分布的eGFP+細胞，并且分布趨勢類似從喙側神經干細胞遷移到嗅球的細胞遷移流，稱之為SFMS。
　　 2.免疫熒光雙標結果發(fā)現(xiàn)，eGFP+細胞與神經干細胞標志物nestin、SVZ區(qū)來源的具有遷移能力神經前體細胞標志物DCX共標，提示SFMS中eGFP+

14、細胞是由SVZ區(qū)遷移而來。
　　 3.P10期，運用蛋白酶抑制劑FN-439抑制MMP9活性后，我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N-439組遷移流(SFMS)中eGFP+細胞數(shù)量較對照組(saline)明顯下降。酶譜檢測也證實，F(xiàn)N-439組微腦回區(qū)MMP9活性較saline組確實顯著降低。
　　 在P20時間點，抑制MMP9活性后，觀察到類似的結果：FN-439組SFMS中eGFP+細胞數(shù)量較saline組明顯下降。同時，酶譜檢測也證實，

15、FN-439組微腦回區(qū)MMP9活性較saline組確實顯著降低。
　　 綜上所述，本研究結果表明：
　　 第一、人MCDs組織中MMP9表達顯著上調，且特征性地高表達于與癲癇放電活性相關的異形細胞(如異形神經元、肥大神經元、巨細胞、氣球樣細胞)上。
　　 第二、我們建立了一個模擬人類微腦回的MCDs大鼠模型，并且證實在P10和P20時刻微腦回區(qū)MMP9蛋白表達及酶活性較對照皮層顯著上調。
　　 第三、與課