基質(zhì)金屬蛋白酶9在腦皮質(zhì)發(fā)育障礙中的作用研究.pdf

1、腦皮質(zhì)發(fā)育障礙(MCDs)是一類以大腦皮層細(xì)胞構(gòu)筑異常為表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是臨床上兒童藥物難治性癲癇的重要病因之一。局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(FCD)和結(jié)節(jié)性硬化(TSC)是MCDs常見的兩種亞型，并且病理學(xué)表現(xiàn)非常類似。對(duì)FCD的病因研究認(rèn)為，F(xiàn)CD是一類由胚胎發(fā)育期異常的神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移和分化所致的發(fā)育性疾病。在FCD三種病理亞型中，Ⅱb型FCD(FCDⅡb)具有最典型的病理改變，且與其他類型相比具有臨床癲癇發(fā)作較早、癲癇發(fā)作頻率高、

2、發(fā)作間期短等特點(diǎn)。TSC是一類有TSC1或者FSC2基因突變?cè)斐傻亩嘞到y(tǒng)多器官常染色體顯性遺傳病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高達(dá)70％的TSC患者中有癲癇發(fā)作，并且常常藥物難以控制。盡管從病因?qū)W的角度出發(fā)，F(xiàn)CDⅡb和TSC并不相同。但是，鑒于他們?cè)诮M織病理學(xué)上共同的改變以及臨床表現(xiàn)的相似性，我們自然而然地推測他們?cè)诎d癇發(fā)作的病理生理學(xué)機(jī)制上有著某種共性。此外，最近的遺傳學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)TSC1基因在FCDⅡb的發(fā)育過程中可能起到重要作用，也在某種程度上支

3、持了我們的猜想。在對(duì)FCDⅡb及TSC致癇研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CDⅡb中局部皮質(zhì)發(fā)育不良區(qū)以及TSC的皮層結(jié)節(jié)是癲癇放電灶，但是具體機(jī)制仍不明確。
　　 迄今為止，神經(jīng)遞質(zhì)受體及離子通道在癲癇發(fā)生中的作用吸引了大多數(shù)學(xué)者的眼球，很少有研究關(guān)注到細(xì)胞外蛋白酶在癲癇發(fā)生中的可能作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的分泌性或者細(xì)胞膜結(jié)合性蛋白水解酶，在胚胎發(fā)育、血管生成、組織重塑等生理過程中發(fā)揮重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中(C

4、NS)，MMPs廣泛地參與到腫瘤生成、炎癥反應(yīng)、缺血、腦創(chuàng)傷等病理過程?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)是MMPs家族中最被大家所熟知的一員，正常情況下先以酶原(pro-MMP9)形式分泌到細(xì)胞外，然后再被分解成活性酶(act-MMP9)形式發(fā)揮生理功能。近來的研究發(fā)現(xiàn)MMP9在皮層發(fā)育、突觸重塑和學(xué)習(xí)記憶等生理功能中發(fā)揮重要的作用。鑒于在癲癇發(fā)生的過程中伴隨著神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織重塑，最近一系列的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)MMP9參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。然而，MM

5、P9在MCDs中的具體作用仍有待研究。
　　 為了闡明MMP9在MCDs中的作用及其可能的機(jī)制，首先，我們利用半定量RT-PCR、western blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了MMP9在MCDs亞型(FCDⅡb和TSC)臨床標(biāo)本中的表達(dá)分布情況；其次，我們利用局部冰凍損傷新生大鼠腦皮質(zhì)建立了一個(gè)模擬人類微腦回的MCDs大鼠模型，并且檢測了MMP9蛋白及酶活性在不同發(fā)育期的表達(dá)情況；最后，為了直觀的了解MMP9在MCDs中的作用

6、，在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究了MMP9對(duì)SVZ區(qū)來源的神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)向微腦回區(qū)遷移的影響。通過這些研究，我們得到以下結(jié)果：
　　 一、MMP9在MCDs患者皮質(zhì)病灶中的表達(dá)分布
　　 1.FCDⅡb及TSC皮層致癇灶中MP9的mRNA水平較正常對(duì)照皮層(CTX)明顯升高。
　　 2.FCDⅡb，TSC及TLE組中MMP9蛋白的酶原表達(dá)水平較CT

7、X明顯增高，而活性酶表達(dá)量僅見FCDⅡb及TSC較CTX明顯增高，TLE與CTX無顯著差異。
　　 3.在正常皮層中可檢測到MMP9表達(dá)，其表達(dá)模式與先前報(bào)道的一致：呈弱到中等強(qiáng)度表達(dá)于神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞上，在灰質(zhì)與白質(zhì)中偶見膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。
　　 4.FCDⅡb病灶內(nèi)呈現(xiàn)出強(qiáng)MMP9免疫反應(yīng)。染色強(qiáng)度評(píng)分提示FCDⅡb中MMP9蛋白表達(dá)較CTX明顯升高。我們進(jìn)一步對(duì)MMP9的細(xì)胞分布表達(dá)模式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)：80％±6.5

8、％的BCs(n=352)強(qiáng)表達(dá)MMP9；89±3.3％的DNs(n=573)強(qiáng)表達(dá)MMP9；83±4.7％的HNs(n=420)強(qiáng)表達(dá)MMP9。同時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞也呈現(xiàn)強(qiáng)MMP9免疫反應(yīng)。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果證實(shí)MMP9分別共定位于vimentin(未成熟膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，常見BCs表達(dá))陽性的BCs(圖1-3 H)NF200(神經(jīng)元標(biāo)志物)陽性的DNs、HNs。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MMP9陽性(MMP9+)的膠質(zhì)細(xì)胞是GFAP+的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而

9、非Ibal+的小
　　 膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 5.在TSC皮層結(jié)節(jié)中，MMP9 IR呈現(xiàn)出與FCDⅡb病灶類似的強(qiáng)反應(yīng)。染色強(qiáng)度評(píng)分提示TSC中MMP9蛋白表達(dá)較CTX明顯升高。進(jìn)一步對(duì)MMP9的細(xì)胞分布表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，77％±5.3％的GCs(n=491)和85％±3.6％的DNs(n=627)呈中等到強(qiáng)MMP9IR。先前的研究發(fā)現(xiàn)，GCs是一類分化程度不一的細(xì)胞，我們免疫雙標(biāo)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)一些MMP9+GCs呈vimen

10、tin+，而另外一些則是NF200+。進(jìn)一步的熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)MMP9+膠質(zhì)細(xì)胞是GFAP+的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而非小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 二、MMP9在FCD大鼠模型微腦回中蛋白、酶活性及細(xì)胞定位研究
　　 1.Western Blotting檢測MMP9蛋白在FCD模型及對(duì)照組中可見，目的蛋白大小為92kD的MMP9蛋白在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均可被檢測出，在P10和P20兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)，F(xiàn)CD組MMP9蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高

11、。
　　 2.明膠酶譜法檢測MMP9蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)，在P10和P20兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)，F(xiàn)CD組MMP9蛋白酶活性較對(duì)照組明顯升高。
　　 3.P10正常大鼠皮層可觀察到MMP9表達(dá)，且主要呈中等強(qiáng)度表達(dá)在錐體神經(jīng)元上。P10 FCD大鼠微腦回區(qū)可觀察到MMP9表達(dá)，光密度值分析提示FCD微腦回區(qū)MMP9表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照組。進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果提示，微腦回區(qū)表達(dá)MMP9的細(xì)胞為NeuN陽性的神經(jīng)元，偶見GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)

12、MMP9。
　　 4.類似于P10的表達(dá)模式，我們觀察到MMP9在P20正常大鼠皮層廣泛表達(dá)，且主要呈中等強(qiáng)度表達(dá)在錐體神經(jīng)元上。而在P20 FCD大鼠微腦回區(qū)可觀察到MMP9表達(dá)主要呈強(qiáng)表達(dá)于錐體神經(jīng)元上。光密度值分析提示FCD微腦回區(qū)MMP9表達(dá)強(qiáng)于正常對(duì)照組。進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果提示，微腦回區(qū)表達(dá)MMP9的細(xì)胞為NeuN陽性的神經(jīng)元，未探及GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MMP9。
　　 三、MMP9對(duì)SVZ區(qū)NPCs向

13、微腦回區(qū)遷移的影響
　　 1.我們成功地將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白腺病毒表達(dá)載體(Ad-eGFP)成功地轉(zhuǎn)染到了SVZ區(qū)細(xì)胞中。并且觀察到，F(xiàn)CD皮層冰凍損傷病灶內(nèi)可見大量散在分布的eGFP+細(xì)胞，并且分布趨勢類似從喙側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞遷移到嗅球的細(xì)胞遷移流，稱之為SFMS。
　　 2.免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，eGFP+細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物nestin、SVZ區(qū)來源的具有遷移能力神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物DCX共標(biāo)，提示SFMS中eGFP+

14、細(xì)胞是由SVZ區(qū)遷移而來。
　　 3.P10期，運(yùn)用蛋白酶抑制劑FN-439抑制MMP9活性后，我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N-439組遷移流(SFMS)中eGFP+細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組(saline)明顯下降。酶譜檢測也證實(shí)，F(xiàn)N-439組微腦回區(qū)MMP9活性較saline組確實(shí)顯著降低。
　　 在P20時(shí)間點(diǎn)，抑制MMP9活性后，觀察到類似的結(jié)果：FN-439組SFMS中eGFP+細(xì)胞數(shù)量較saline組明顯下降。同時(shí)，酶譜檢測也證實(shí)，

15、FN-439組微腦回區(qū)MMP9活性較saline組確實(shí)顯著降低。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明：
　　 第一、人MCDs組織中MMP9表達(dá)顯著上調(diào)，且特征性地高表達(dá)于與癲癇放電活性相關(guān)的異形細(xì)胞(如異形神經(jīng)元、肥大神經(jīng)元、巨細(xì)胞、氣球樣細(xì)胞)上。
　　 第二、我們建立了一個(gè)模擬人類微腦回的MCDs大鼠模型，并且證實(shí)在P10和P20時(shí)刻微腦回區(qū)MMP9蛋白表達(dá)及酶活性較對(duì)照皮層顯著上調(diào)。
　　 第三、與課