基質金屬蛋白酶MMP2-9在鉛導致腦屏障系統(tǒng)破壞中的機制研究.pdf

1、鉛是一種在自然界中廣泛存在的重金屬。以往大量研究證實：鉛在人體的蓄積可以引起鉛中毒，引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內的全身性毒性。兒童是鉛的易感人群，由于其代謝、發(fā)育等方面的特點，對鉛的神經(jīng)毒性特別敏感。鉛中毒可造成兒童神經(jīng)系統(tǒng)不可逆損傷，影響智力發(fā)育，損傷認知和學習記憶功能。所以，兒童鉛中毒一直以來是全世界關注的重大公共衛(wèi)生問題之一。
　　大腦屏障由血腦屏障（blood-brain barrier,BBB）、血腦脊液屏障（blood-C

2、SF barrier,BCB）及腦脊液-腦屏障（CSF-brain barrier,CBB）三部分組成。對于限制血液和大腦組織之間大分子及有害物質的通過、維持大腦內環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的作用。鉛對腦屏障中的毛細血管具有較高的親和力，可以通過損傷大腦毛細血管內皮細胞的膜結構，破壞在內皮細胞間形成的緊密連接（tight junction，TJ），從而通過血腦屏障進入大腦實質中。本實驗室以往研究發(fā)現(xiàn)：發(fā)育期鉛暴露可以損害大鼠BBB的結構和功能，

3、引起屏障通透性的增加和緊密連接蛋白的表達水平下降，但其調控分子機制尚不完全清楚。
　　基質金屬蛋白酶（MMPs）是細胞外基質蛋白酶體中重要的組成部分，其在細胞外基質的重塑和降解中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示MMP-2，MMP-9可以介導claudin-5和occludin這兩種緊密連接蛋白的降解，從而導致血腦屏障的破壞。而MMP-2/9是否在鉛暴露誘導的腦屏障損傷發(fā)揮作用，目前還沒有相關研究。
　　為進一步闡明鉛損傷BBB、B

4、CB通透性的機制，本實驗通過建立體外BBB、BCB細胞模型，觀察鉛暴露對腦屏障的損傷作用，并研究星形膠質細胞釋放的MMP-2/9在鉛致腦屏障系統(tǒng)損傷和緊密連接蛋白表達降低中的作用，，為進一步闡明鉛誘導腦屏障系統(tǒng)損傷的分子機制、探討可能的防護措施提供研究基礎。
　　目的：
　　通過建立體外BBB和BCB模型，觀察鉛體外BBB和BCB模型的通透性、緊密連接蛋白的表達水平、以及膠質細胞釋放的MMP-2/9水平的影響，明確MMP-2

5、/9在鉛誘導大腦屏障損傷中的作用和可能機制。
　　方法：
　　1．采用C6細胞及人大腦微血管內皮細胞（HBMEC），建立合適的BBB體外共培養(yǎng)細胞系模型；采用Z310細胞系，建立BCB體外細胞模型。
　　2．采用跨內皮電阻檢測（TEER法）及葡聚糖法檢測鉛對 BBB、BCB模型通透性的影響。
　　3．Western blot及免疫熒光法法檢測屏障中TJPrs表達及分布情況。
　　4．qRT-PCR、West

6、ern blot法檢測MMPs mRNA及蛋白表達。
　　5．明膠酶譜法檢測細胞培養(yǎng)液中MMPs酶活性。
　　6．采用MMPs組織抑制劑抑制MMPs活性，觀察其對鉛所致屏障損傷的保護作用。
　　結果：
　　1．MMP2/9在血腦屏障中的機制研究
　　1)膠質細胞C6對BBB的影響
　　a)HBMEC細胞加入未經(jīng)Pb處理的C6條件培養(yǎng)液，共培養(yǎng)模型經(jīng)過10μM鉛處理后不會引起B(yǎng)BB屏障通透性出現(xiàn)大的變化

7、（p>0.05）；且24h的鉛處理后，ZO-1及Occludin兩種緊密連接蛋白的變化也不明顯（p>0.05）。
　　b)HBMEC細胞在加入Pb處理后C6條件培養(yǎng)液時，共培養(yǎng)模型經(jīng)過10μM鉛處理后BBB的通透性會顯著增加（p<0.05）；24h的鉛處理后，ZO-1及Occludin的表達明顯呈下降趨勢（p<0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴效應。
　　2)BBB中鉛暴露對MMP2/9的影響
　　2.5、5、10μM的Pb分

8、別處理12h、24h后，可以使C6膠質細胞中MMP2及MMP9的mRNA水平上表達上升（p<0.05），且具有劑量依賴效應；蛋白表達增高（p<0.05），使MMP2的酶活性顯著提升（p<0.05），并具有一定的劑量依賴效應。
　　3) MMP2抑制劑對鉛所致BBB損傷的保護作用
　　C6細胞加入APR100（MMP2組織特異性抑制劑）后，鉛暴露24h后Zo-1及Occludin兩種緊密連接蛋白的表達升高（p<0.05），屏障

9、通透性得到了一定恢復（p<0.05）。
　　2．MMP2/9在血腦脊液屏障中的機制研究
　　1)鉛暴露對BCB屏障功能的影響
　　10μM Pb暴露造成BCB模型通透性的改變（p<0.05），并導致ZO-1及Occludin表達水平降低（p<0.01），表明Pb可以破壞BCB完整性。
　　2)BCB中鉛暴露對MMP2/9的影響
　　BCB模型中，10μM以下的鉛暴露對于MMP2/9 mRNA水平及蛋白表達水

10、平上的改變均不顯著（p>0.05）。
　　結論：
　　1.鉛暴露能夠破壞體外BBB模型的通透性，使TJPrs中ZO-1和Occluudin表達下降。
　　2.鉛暴露后星型膠質細胞中MMP2及MMP9表達水平增加，且酶活性升高；抑制MMP2活性，能夠使TJPrs的表達有所回升，屏障通透性也有一定程度的恢復。
　　3.鉛能夠破壞體外BCB模型的通透性，抑制緊密連接蛋白的表達，但MMPs表達沒有改變，這說明MMPs在鉛