基質(zhì)金屬蛋白酶在糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥中的作用研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)可發(fā)揮非特異性抗炎、抗毒、抗休克及其免疫抑制等藥理學效應，因而被廣泛用作炎癥、器官移植、自身免疫疾病及腫瘤治療等領域。但是作為其主要副作用之一的糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIO)的發(fā)病率卻逐年升高，成為了臨床上迫切需要解決的難題。作為最為常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，GIO是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構破壞、骨密度減低、骨的脆

2、性增加并且骨折風險性升高為特征的代謝性骨病，GIO的發(fā)病機制及其防治也越來越受到關注。長期大劑量應用GC后，成骨細胞的增殖受到抑制，成骨細胞和骨細胞的凋亡數(shù)量增加，最終導致成骨細胞的骨形成能力下降;GC還可使破骨細胞的生成增多，增加破骨細胞的數(shù)目，同時增強其活性，促進破骨細胞性骨吸收，進而導致骨量丟失，造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類高度保守的蛋白水解酶，由鋅離子依

3、賴性酶組成，可降解基底膜和細胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)，從而參與組織再造和器官形成。MMPs通過參與骨改建過程，在骨組織的新陳代謝活動中發(fā)揮著極其重要的作用，同時其基因表達、蛋白質(zhì)合成及表達均受到多種生長因子、細胞因子及激素等因素不同程度的調(diào)節(jié)。因此，對MMPs的研究可以為骨質(zhì)疏松的治療提供一定的理論依據(jù)及新的思路。
　　目的:
　　本課題通過檢測GIO小鼠骨組織中MMP-2、9、13表達水平的變化及其在體外給予GC后檢測骨樣細

4、胞中MMP-2、13mRNA的表達變化，探討MMPs表達異常與GIO的關系，為GIO的預防和治療方案的選擇提供一定的理論依據(jù)。
　　方法:
　　第一階段:本實驗選用SPF級7周齡昆明小鼠（20只），隨機分為實驗組和對照組。在適應性喂養(yǎng)7天后，實驗組小鼠經(jīng)灌胃給予氫化潑尼松(15mg/kg)，隔日給藥1次;對照組給予等量PBS。2周后行4％多聚甲醛經(jīng)心臟內(nèi)灌注固定處死小鼠，取脛骨進行常規(guī)固定、脫鈣、石蠟包埋、切片，通過HE染色

5、觀察組織學改變;進行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和組織蛋白酶K(CK)的免疫組織化學染色觀察破骨細胞數(shù)量、分布及活性;采用免疫組織化學方法檢測骨組織中SOST、DMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-13的表達;并對上述結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。第二階段:我們通過體外培養(yǎng)小鼠MLO-Y4骨樣細胞系，并給予不同濃度(10-6M，10-7M，10-8M)的地塞米松(Dex)進行干預。采用MTT法檢測細胞增殖;采用實時定量熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶

6、鏈反應(qRT-PCR)檢測骨樣細胞中MMP-2、MMP-13mRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　第一階段:
　　1.骨小梁:相比對照組，實驗組小鼠①脛骨松質(zhì)骨區(qū)域骨量(BV/TV)明顯減少，生長板變薄，皮質(zhì)骨變窄;②脛骨松質(zhì)骨中TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色陽性破骨細胞明顯增多，且CK免疫組織化學染色提示破骨吸收較為活躍;③脛骨松質(zhì)骨區(qū)域內(nèi)MMP-2，MMP-9，MMP-13表達明顯增多。
　　2.皮質(zhì)骨:相

7、比對照組，實驗組小鼠①脛骨皮質(zhì)骨中骨細胞數(shù)量明顯減少;②脛骨皮質(zhì)骨中骨陷窩不同程度的擴大，并且空陷窩的數(shù)量增加;③脛骨皮質(zhì)骨中出現(xiàn)大小不一的裂隙，在HE染色中呈現(xiàn)與周圍正常骨皮質(zhì)不均一的染色狀態(tài);④脛骨皮質(zhì)骨中DMP-1表達有所減少，SOST表達增多;MMP-2表達明顯增加，且主要集中在骨細胞及骨陷窩內(nèi)表達;MMP-13表達有所增加，并且主要在裂隙中表達;MMP-9表達無明顯差異。
　　第二階段:
　　1.MTT法顯示，加入

8、Dex后，MLO-Y4細胞增殖受到抑制，并與給藥濃度和時間相關。
　　2.qRT-PCR結(jié)果表明，Dex增加了MLO-Y4骨樣細胞中MMP-2、-13mRNA的表達水平，并呈劑量、時間依賴效應。
　　結(jié)論:
　　應用糖皮質(zhì)激素后，小鼠脛骨骨小梁中MMP-2、9、13的表達明顯增多提示松質(zhì)骨骨量減少與MMP-2、9、13增多相關。皮質(zhì)骨中骨細胞發(fā)生骨細胞性骨溶解，MMP-2、13表達增多并且多集中在骨細胞及皮質(zhì)骨裂隙中，