糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬的功能與調(diào)控研究.pdf

1、目的：糖皮質(zhì)激素目前被廣泛應(yīng)用于非感染性炎癥和自體免疫性疾病的臨床治療。長(zhǎng)療程的糖皮質(zhì)激素會(huì)產(chǎn)生多種副作用，其對(duì)骨組織的影響會(huì)導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥（GIOP）。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的臨床表現(xiàn)包括骨密度下降和骨折。其中骨折在成年患者中的發(fā)生率可達(dá)30％-50%。過(guò)量的糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞的直接作用造成骨量丟失。以往的研究表明長(zhǎng)期口服糖皮質(zhì)激素會(huì)引起骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的凋亡，同時(shí)可以延長(zhǎng)破骨細(xì)胞的生存周期。

2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）對(duì)于維持骨組織動(dòng)態(tài)平衡有著非常關(guān)鍵的作用。BMSCs在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機(jī)理中扮演著重要角色，近年來(lái)其相關(guān)研究引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。由于新骨的形成主要依賴于由BMSCs分化而成的成骨細(xì)胞，高濃度糖皮質(zhì)激素對(duì)BMSCs的負(fù)面影響毫無(wú)疑問(wèn)會(huì)造成GIOP中的骨量丟失。因此，GIOP中BMSCs功能和數(shù)量的保護(hù)對(duì)疾病治療來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。自噬能夠在細(xì)胞處于應(yīng)激環(huán)境時(shí)被激活，成為一種生存傾向性的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。這一生理性過(guò)程

3、對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)，存活，發(fā)育及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)來(lái)說(shuō)十分重要，在許多疾病的病理生理過(guò)程中也被越來(lái)越多地提及。然而，自噬是否參與了糖皮質(zhì)激素對(duì)BMSCs造成損傷的過(guò)程目前尚不清楚。四甲基吡嗪（TMP），作為從傳統(tǒng)藥用植物川芎中提取出的生物活性成分，在以往研究中被報(bào)道在諸多細(xì)胞類型中具有抗炎，抗癌，抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用。我們的研究假設(shè)認(rèn)為自噬參與了糖皮質(zhì)激素環(huán)境下BMSCs應(yīng)激的過(guò)程，我們?cè)噲D闡釋自噬在此環(huán)境下發(fā)揮的功能并應(yīng)用一種相對(duì)安全且有特異性

4、的小分子化合物通過(guò)調(diào)控自噬保護(hù)受損傷的BMSCs，以期探索一種預(yù)防和治療GIOP的新策略。
　　方法：將原代大鼠BMSCs培養(yǎng)至第3代后,分別加入三種不同劑量的地塞米松（Dex）,使三個(gè)處理組培養(yǎng)基中地塞米松的終濃度分別達(dá)到10-8 M，10-7 M，10-6 M。加入后處理48h。對(duì)照組使用不做任何處理的普通培養(yǎng)基。通過(guò)透射電鏡觀察自噬小體。使用LC3免疫熒光細(xì)胞化學(xué)，LC3蛋白免疫印跡等方法檢測(cè)細(xì)胞自噬水平。自噬功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中

5、，加入自噬抑制劑3甲基腺嘌呤3-MA處理的終濃度為5mM。加入自噬激動(dòng)劑雷帕霉素Rapa myc in的終濃度為10nM。3-MA與Rapa myc in均在地塞米松處理24h后加入。
　　將BMSCs以每孔2.5×105個(gè)接種到6孔板上，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，棄掉培養(yǎng)基，加入Dex使培養(yǎng)基終濃度為10-6M，培養(yǎng)24h。再加入含濃度0μM（空白對(duì)照組，Contro l），50μM，100μM或200μM的TMP無(wú)血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)

6、48h。應(yīng)用Cell Counting Kit-8檢測(cè)液檢測(cè)細(xì)胞增殖活力。使用流式細(xì)胞儀Annexin V/ PI雙染、TUNEL試劑盒染色及Caspase-3活性檢測(cè)等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　將BMSCs接種到6孔板上，長(zhǎng)滿后加入配制好的成骨誘導(dǎo)液（高糖DMEM培養(yǎng)基，β-甘油磷酸鈉，抗壞血酸，10-8M地塞米松，10%胎牛血清，1%青鏈霉素）培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)至第14天，除對(duì)照組外加入10-6M地塞米松處理24h，再分別給予0

7、μM，50μM，100μM，200μM的TMP處理48h。行堿性磷酸酶染色檢測(cè)ALP活性。同時(shí)提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行成骨分化相關(guān)基因Alp、Col1a1、Ocn、Osx的表達(dá)水平檢測(cè)。誘導(dǎo)培養(yǎng)至第21天，茜素紅染色檢測(cè)鈣沉積情況。
　　應(yīng)用自噬流阻滯劑巴弗洛霉素A1（Baf）并檢測(cè)p62蛋白的表達(dá)來(lái)研究TMP對(duì)Dex處理下BMSCs自噬流的影響。將BMSCs接種到6孔板上，加入Dex使培養(yǎng)基終濃度為10-6M

8、，培養(yǎng)24h。再加入含濃度0μM，50μM的TMP或100nM的Ba f無(wú)血清培養(yǎng)基至孔板中，培養(yǎng)48h。接著用Western-blot檢測(cè)了LC3及p62蛋白的表達(dá)。我們還在加入了AMPK通路抑制劑Compound C后，檢測(cè)磷酸化AMPK，總AMPK，磷酸化mTOR，總mTOR蛋白的表達(dá)水平變化從而研究TMP調(diào)控自噬的信號(hào)通路。
　　將SD大鼠置于實(shí)驗(yàn)室條件下，即通氣良好的20℃恒溫環(huán)境中，每12小時(shí)光照與黑暗交替，水糧足量，

9、自由取用。適應(yīng)1周后，每天腹腔注射等體積的蒸餾水（對(duì)照組，Control，n=10）或2.5mg/kg潑尼松龍（n=30），持續(xù)12周。首次注射后一周開始，將30只注射潑尼松龍的大鼠隨機(jī)分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每天分別增加注射等體積的芝麻油（安慰劑對(duì)照，即糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松模型組，n=10），5mg/k g（ n=10）或20mg/kg（n=10）的TMP溶液。持續(xù)注射12周后采用脫頸法處死取材。
　　動(dòng)物模型給藥完成大鼠脫頸處死前的第

10、12天和第2天，以5mg/k g劑量腹腔注射鈣黃綠素進(jìn)行熒光素標(biāo)記。留取左側(cè)股骨固定后進(jìn)行硬組織塑料包埋并切片。應(yīng)用骨形態(tài)學(xué)測(cè)量系統(tǒng)軟件計(jì)算礦鹽沉積率（Mineral apposition rate，MAR），礦化面積與骨面積比例（Mineralizing surface/bone surface，MS/BS）以及骨形成率（Bone formation rate，BFR）。
　　給藥完成大鼠脫頸處死后留取每只大鼠的右側(cè)股骨和第四椎

11、骨，固定后進(jìn)行顯微CT掃描。應(yīng)用軟件重建興趣區(qū)域3D圖像并定量分析骨密度（ BMD），相對(duì)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV），骨小梁數(shù)量（Tb.N），骨小梁厚度（Tb.Th），結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）和骨小梁分離度（Tb.Sp）等參數(shù)。
　　注射給藥干預(yù)12周后，分別從各組大鼠股骨與脛骨中提取 BMSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)，收集培養(yǎng)第一代細(xì)胞。流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI，Caspase-3活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡。透射電鏡檢測(cè)自噬小體，W

12、estern-blot檢測(cè)LC3蛋白檢測(cè)細(xì)胞自噬水平。
　　結(jié)果：
　　1.我們的數(shù)據(jù)顯示，從糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠中直接提取的BMSCs的增殖能力下降，同時(shí)在模型體內(nèi)提取出的BMSCs中觀察到自噬小體增多的現(xiàn)象。
　　2.三種劑量（10-8M，10-7M，10-6M）的地塞米松均可以顯著促進(jìn)BMSCs自噬的發(fā)生。10-8M和10-7M濃度的地塞米松并不影響B(tài)MSCs的增殖活力。而10-6M劑量組則使BMSCs活力明

13、顯降低。應(yīng)用了自噬抑制劑3-MA和自噬激動(dòng)劑Rapa后，結(jié)果顯示自噬緩解了高濃度地塞米松對(duì)BMSCs增殖活力的抑制作用，抑制了地塞米松引起的BMSCs凋亡。
　　3.我們發(fā)現(xiàn)50μM的TMP能夠進(jìn)一步顯著上調(diào)地塞米松暴露下BMSCs的自噬強(qiáng)度，同時(shí)抑制地塞米松引起的細(xì)胞凋亡。而TMP的這種抗凋亡效果正是由于其對(duì)自噬的調(diào)控作用所介導(dǎo)的。TMP本身并不能提高BMSCs的基礎(chǔ)自噬水平，其調(diào)控自噬的效應(yīng)是嚴(yán)格與糖皮質(zhì)激素處理的應(yīng)激環(huán)境相關(guān)

14、聯(lián)的。加入AMPK抑制劑Compound C后的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步闡明了TMP對(duì)BMSCs自噬的調(diào)控作用是通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的。此外，TMP處理組（50μM，100μM，200μM）與單獨(dú)地塞米松處理組相比顯著增加了BMSCs成骨分化過(guò)程中的ALP活性和鈣結(jié)節(jié)礦化程度，同時(shí)上調(diào)了成骨相關(guān)基因ALP,COL1A1,OCN和OSX的表達(dá)水平。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TMP體內(nèi)注射干預(yù)12周能夠加速糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠

15、骨形成并改善骨量丟失。TMP注射干預(yù)組大鼠體內(nèi)提取的第一代BMSCs與單純糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠組相比，凋亡率明顯減少而LC3-II/LC3-I比率顯著提高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的自噬水平。說(shuō)明TMP能夠作用于體內(nèi)糖皮質(zhì)激素環(huán)境下的BMSCs。研究結(jié)論
　　綜上所述，糖皮質(zhì)激素能夠誘導(dǎo)BMSCs自噬發(fā)生，自噬能夠維持BMSCs增殖活力并抑制高濃度糖皮質(zhì)激素造成的凋亡，在糖皮質(zhì)激素刺激的應(yīng)激環(huán)境下扮演保護(hù)細(xì)胞的角色。TMP能夠體外在地塞米松