衰老性骨質(zhì)疏松中自噬與骨髓間充質(zhì)干細胞增齡性變化的關(guān)系的研究.pdf

1、衰老性骨質(zhì)疏松(Senile Osteoporosis)是年齡增長引起的以骨吸收大于骨生成為特征的進行性代謝性疾病,表現(xiàn)為骨量和骨強度的顯著降低,具體表現(xiàn)為:皮質(zhì)骨變薄、骨小梁數(shù)目減少、骨密度降低、骨間空隙增大、骨脆性增加,發(fā)生骨折的危險性增加。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells,BMMSCs)是位于骨髓腔內(nèi)的具有自我更新能力和多向分化能力的一類中胚層來源的成體干細胞,在成骨、破骨平衡

2、中發(fā)揮重要作用,其隨著年齡的增長出現(xiàn)數(shù)量變化及生物學功能退化,是導(dǎo)致骨骼衰老性變化的重要因素。自噬(Autophagy)是細胞內(nèi)通過自噬體(Autophagosome)包繞胞漿內(nèi)底物如折疊錯誤蛋白質(zhì)及損傷線粒體等并將其運送至溶酶體(Lysosome)降解后循環(huán)再利用的機制,其水平與衰老及衰老性疾病密切相關(guān),但是,自噬在BMMSCs中增齡性變化中起何種作用及作用機制并不清楚,因此本文研究了衰老性骨質(zhì)疏松中BMMSCs的增齡性變化、自噬變化

3、以及自噬在其增齡性變化中的作用及機制,為衰老性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及可能的治療手段的研究提供了新的方向。
　　【實驗?zāi)康摹浚?br>　　1.探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增齡性變化;
　　2.探討自噬在自然衰老小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中的變化;
　　3.探討自噬在小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增齡性變化中的作用及作用機制。
　　【實驗方法】：
　　1.Micro-CT掃描并重建年輕、年老小鼠股骨遠端骨小梁形態(tài);采用全骨髓培養(yǎng)法

4、分離培養(yǎng)并純化年輕、年老小鼠BMMSCs后,流式細胞技術(shù)(Flow cytometry,FCM)鑒定細胞表面標志分子;克隆形成實驗檢測并比較兩種BMMSCs的自我更新能力;成骨、成脂誘導(dǎo)實驗檢測兩種細胞的多向分化能力;流式細胞技術(shù)檢測并比較兩種細胞的增殖、細胞周期和凋亡的生物學特性。
　　2.蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測并比較年輕、年老小鼠BMMSCs衰老相關(guān)蛋白乙?；疨53、P21、P16的表達以及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

5、TERT蛋白的表達;活性氧簇（reactive oxygen species,ROS)試劑盒檢測并比較兩種細胞的ROS水平。
　　3.實時定量酶連聚合反應(yīng)法(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測并比較年輕、年老小鼠BMMSCs自噬相關(guān)基因的表達;Western Blot檢測并比較兩種細胞的自噬相關(guān)蛋白分子的表達;免疫熒光染色檢測并比較兩種細胞中LC3分子的表達;透射電子顯微鏡(

6、Transmission Electron Microscopy,TEM)觀察兩種細胞的自噬體形態(tài)及數(shù)量。
　　4.Western Blot檢測不同濃度自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)和自噬抑制劑3甲基腺嘌呤(3-methyl-adenine,3-MA)對 BMMSCs自噬水平的影響,篩選有效濃度;RT-PCR檢測自噬激活劑和自噬抑制劑對年輕、年老小鼠BMMSCs的細胞周期相關(guān)基因及細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響;ROS試劑盒

7、檢測自噬激活劑和自噬抑制劑對兩種細胞 ROS水平的影響。
　　【實驗結(jié)果】：
　　1.Micro-CT結(jié)果顯示:年老小鼠出現(xiàn)明顯骨質(zhì)疏松;FCM鑒定年輕、年老小鼠BMMSCs表面標記物結(jié)果顯示:兩種細胞表面標記物的陽性和陰性表達均符合間充質(zhì)干細胞特性;克隆形成實驗結(jié)果顯示:兩種細胞均能形成克隆集落,年老組較年輕組的克隆集落小且少,說明年老組細胞自我更新能力低于年輕組;成骨、成脂誘導(dǎo)兩種細胞分化后,茜素紅,油紅O染色證明兩種細

8、胞均具有成骨、成脂分化的能力,年老組細胞成骨能力明顯低于年輕組,成脂能力明顯高于年輕組;FCM檢測顯示:年老組細胞增殖能力明顯低于年輕組(P<0.05)、細胞周期(G2+S期)明顯低于年輕組(P<0.05)、凋亡水平明顯高于年輕組(P<0.05)。
　　2.Western Blot結(jié)果顯示:年老組BMMSCs乙?；疨53、P21、P16蛋白分子的表達明顯高于年輕組細胞;年老組BMMSCs TERT蛋白分子的表達明顯低于年輕組細胞,

9、提示年老組細胞端粒酶活性較年輕組低;ROS試劑盒激光共聚焦顯微鏡觀察顯示:年老組BMMSCs熒光強度明顯高于年輕組細胞,提示年老組細胞ROS水平明顯高于年輕組。
　　3.RT-PCR檢測兩種細胞自噬相關(guān)基因表達,結(jié)果提示:年老小鼠 BMMSCs Beclin1、LC3基因表達明顯低于年輕組細胞(P<0.05);Western Blot檢測兩種細胞自噬相關(guān)蛋白表達,結(jié)果提示:年老小鼠BMMSCs Beclin1、LC3II/LC3I

10、蛋白表達明顯低于年輕組細胞;激光共聚焦顯微鏡觀察兩種細胞LC3熒光強度,結(jié)果提示:年老小鼠BMMSCs熒光強度明顯低于年輕組細胞;透射電子顯微鏡觀察兩種細胞亞顯微結(jié)構(gòu),結(jié)果提示:兩種細胞內(nèi)均可觀察到典型的自噬體結(jié)構(gòu),年老組細胞自噬體少于年輕組細胞。
　　4.Western Blot結(jié)果顯示:100nM雷帕霉素較其他濃度藥物刺激能明顯提高BMMSCs中Beclin1的表達,為最佳濃度,5mM3-MA較其他濃度藥物刺激能明顯降低BMM

11、SCs中Beclin1的表達,為最佳濃度;RT-PCR結(jié)果顯示:雷帕霉素和3-MA均抑制細胞周期相關(guān)基因CyclinD1(CCND1)、CyclinD2(CCND2)的表達;RT-PCR結(jié)果顯示:雷帕霉素對年輕細胞凋亡相關(guān)基因 Caspase3、Caspase8無明顯影響,對年老細胞促進凋亡相關(guān)基因 Caspase3、Caspase8的表達,而3-MA對年輕、年老細胞均抑制 Caspase3、Caspase8的表達。激光共聚焦顯微鏡觀察

12、自噬激活劑和自噬抑制劑對ROS變化實驗結(jié)果顯示:10-4M H2O2刺激年輕組細胞后其熒光強度高于年輕組對照組細胞,說明H2O2能顯著提高細胞ROS水平;100nM雷帕霉素+10-4M H2O2組細胞熒光強度低于H2O2刺激組,說明自噬激活能有效降低H2O2刺激引起的ROS水平;100nM雷帕霉素刺激年老組細胞后其熒光強度明顯低于年老組對照組細胞,說明激活自噬能有效降低年老細胞ROS水平;5mM3-MA刺激年輕組細胞后,其熒光強度明顯高

13、于年輕組對照組細胞,說明抑制自噬能明顯提高細胞的ROS水平。
　　【結(jié)論】：
　　1.衰老BMMSCs出現(xiàn)一系列增齡性變化,表現(xiàn)為增殖能力下降,凋亡水平升高,成骨能力下降,成脂能力升高,乙?；疨53、P21、P16蛋白表達升高,端粒酶活性降低,ROS水平升高。
　　2.衰老BMMSCs的自噬水平較年輕細胞明顯降低。
　　3.激活自噬能降低BMMSCs的ROS水平,抑制自噬能提高BMMSCs的ROS水平;調(diào)節(jié)自噬可