大劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的MiroRNA調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 目前，激素性股骨頭壞死在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head, ONFH)的發(fā)病率中已經(jīng)居于首位，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，致殘率高，造成了極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但其病因還不是十分清楚?；诓±硌芯浚藗儼l(fā)現(xiàn)除微循環(huán)障礙導(dǎo)致的毛細(xì)血管的微栓塞引起局部骨內(nèi)壓增高，局部缺血壞死外，激素導(dǎo)致的骨髓間充干細(xì)胞成骨分化能力的改變，使得骨壞死和修復(fù)平衡打破，繼而導(dǎo)致股骨頭壞死塌陷也是發(fā)病機(jī)

2、制重要的環(huán)節(jié)之一。
　　 隨著分子生物學(xué)和表觀遺傳學(xué)的進(jìn)展，新近的研究發(fā)現(xiàn)microRNA在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中起著非常重要的調(diào)控作用，而激素性股骨頭壞死的過程中，激素有可能是通過microRNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能而影響骨壞死的發(fā)生或修復(fù)。因此，我們擬通過對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用不同濃度的地塞米松刺激來尋找差異性表達(dá)的microRNA，并進(jìn)一步驗(yàn)證其功能，為激素性股骨頭壞死的發(fā)生機(jī)制和臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療提供有

3、力的依據(jù)。
　　 研究目的
　　 1．分離、培養(yǎng)及鑒定MSC；
　　 2．建立大劑量糖皮質(zhì)激素抑制干細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞模型；
　　 3．通過對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用不同濃度地塞米松刺激，明確其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的調(diào)控作用；
　　 4．基因芯片篩選不同濃度地塞米松刺激后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的microRNA表達(dá)差異，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，明確其與干細(xì)胞成骨分化之間的關(guān)系，尋找可能潛在的關(guān)鍵基因;
　　

4、 5．定制microRNA mimics及inhibitors，完成對(duì)microRNA功能驗(yàn)證。
　　 研究方法
　　 獲取健康成人骨髓，經(jīng)分離、培養(yǎng)、傳代后取得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第三代，以不同濃度地塞米松成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，分別于不同的時(shí)間點(diǎn)以ALP、茜素紅染色，觀察細(xì)胞增殖及成骨分化能力;脫離成骨誘導(dǎo)體系單純以不同濃度地塞米松干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48小時(shí)，獲取RNA后送檢基因芯片，篩選差異性表達(dá)的基因，并進(jìn)行生

5、物信息學(xué)分析，獲取此調(diào)控途徑中的關(guān)鍵microRNA，定制microRNA mimics及inhibitors，完成對(duì)microRNA功能驗(yàn)證。
　　 研究結(jié)果
　　 1．采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法可以從骨髓中成功分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)的判別，成骨、成脂能力的檢測(cè)及相關(guān)的細(xì)胞表型鑒定得以證實(shí)。
　　 2.10-7mol/L地塞米松成骨誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其細(xì)胞增殖及成骨

6、分化均較10-9mol/L組差，且細(xì)胞成脂肪分化的趨勢(shì)明顯增強(qiáng);相關(guān)成骨基因的檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度地塞米松培養(yǎng)12天左右，骨鈣蛋白、骨橋蛋白、成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2等表達(dá)量在10-9mol/L組比10-7mol/L明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3．不同濃度的地塞米松可導(dǎo)致的miRNA表達(dá)差異，且在同種異體個(gè)體之間具有相對(duì)一致的表達(dá)趨勢(shì)，其中miRNA378d/f/g、miRNA1268a/b、mi

7、RNA196a/b等在10-7mol/L明顯上調(diào)，而miRNA422a、miRNA378h/i/c、miRNA29a等則在10-9mol/L組高表達(dá)。
　　 4．在具有共同表達(dá)趨勢(shì)的miRNA中，選取感興趣的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)miRNA378、miRNA23、miRNA29的靶基因分別是成骨信號(hào)調(diào)節(jié)通路上的BMP2、Runx2、DUSP2。
　　 結(jié)論
　　 1．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外能夠被分