四環(huán)素誘導(dǎo)大鼠靶向PPARγ基因沉默治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、構(gòu)建大鼠PPARγ基因的tet-on慢病毒載體，體外實(shí)驗(yàn)確定載體對(duì)大鼠BMSCs成脂與成骨分化的影響
　　目的:分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs。構(gòu)建大鼠PPARγ基因shRNA的Tet-on慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，在四環(huán)素的誘導(dǎo)下確定其沉默效應(yīng)及對(duì)大鼠BMSCs成脂與成骨分化的影響。
　　方法:采用貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，SABC法進(jìn)行鑒定。針對(duì)大鼠PPARγ基因特異序列，通過(guò)質(zhì)粒重組、病毒包裝及測(cè)序驗(yàn)證

2、，構(gòu)建pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體，設(shè)空白對(duì)照組（Control組）、非特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（shNTC）、慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（shPPARγ）。分別轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后，在四環(huán)素誘導(dǎo)下確定其沉默效應(yīng)及最佳四環(huán)素誘導(dǎo)濃度。成脂誘導(dǎo)后RT-PCR檢測(cè)成脂基因C/EBP?、ADD1 mRNA的表達(dá)，Western blotting檢測(cè)C/EBP?、ADD1蛋白的表達(dá)，油紅O染色檢測(cè)其成脂細(xì)胞分化。成骨誘導(dǎo)后RT-PCR檢測(cè)成骨基

3、因collagen I和 Cbfa1/Runx2的表達(dá)，Western blotting檢測(cè)collagen I和 Cbfa1/Runx2蛋白的表達(dá)，通過(guò)茜素紅染色、鈣含量分析及ALP活性測(cè)定檢測(cè)成骨細(xì)胞分化。
　　結(jié)果:通過(guò)貼壁法可獲得較純化的大鼠BMSCs，SABC法鑒定細(xì)胞表面表達(dá)CD44，CD54，CD71，不表達(dá)CD34，CD45。構(gòu)建針對(duì)大鼠PPARγ基因的四環(huán)素誘導(dǎo)慢病毒載體pTRIPZ/PPARγ-shRNA測(cè)序結(jié)

4、果與設(shè)計(jì)的序列相符合，滴度為3.6×10E8 TU/ml，轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后可表達(dá)紅色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率70％以上。在20μg/ml的四環(huán)素誘導(dǎo)下可達(dá)到92%的沉默效果。成脂誘導(dǎo)后shPPARγ組相對(duì)于Control組ADD1、 C/EBPαmRNA及蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），shNTC組與Control組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），成脂誘導(dǎo)2w后各組細(xì)胞油紅O染色結(jié)果，shPPARγ組細(xì)胞脂滴聚集明顯減少，成脂分化

5、明顯受阻。各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，shPPARγ組相對(duì)于Control組collagen I、Cbfa1/Runx2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），而shNTC組與Control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。成骨誘導(dǎo)2w后各組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果，shPPARγ組細(xì)胞紅色鈣結(jié)節(jié)大量聚集，成骨分化明顯增強(qiáng)，鈣含量測(cè)定結(jié)果，shPPARγ組細(xì)胞明顯高于Control組及shNTC組，成骨誘導(dǎo)2w后各組細(xì)胞ALP活性測(cè)定，s

6、hPPARγ組細(xì)胞明顯高于Control組及shNTC組, shNTC組與Control組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建大鼠pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后，在四環(huán)素誘導(dǎo)下可獲得穩(wěn)定的沉默效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠BMSCs有抑制成脂、促進(jìn)成骨的作用。
　　第二部分、四環(huán)素在大鼠股骨中的代謝動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:探討四環(huán)素在大鼠股骨骨組織及骨髓組織的代謝規(guī)律。<

7、br>　　方法:36只大鼠隨機(jī)分為12組，一個(gè)對(duì)照組及11個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，其余大鼠采用四環(huán)素灌胃。分別在不同時(shí)間點(diǎn)取股骨骨組織及骨髓組織采用蛋白沉淀法提取樣本，以甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定每個(gè)樣本中四環(huán)素含量，繪制時(shí)間-濃度曲線。取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠股骨，經(jīng)過(guò)NaOH溶液處理后，在熒光顯微鏡下觀察其熒光強(qiáng)度，并繪制時(shí)間-熒光信號(hào)強(qiáng)度曲線。
　　結(jié)果:通過(guò)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在股骨及骨髓中檢測(cè)出

8、四環(huán)素藥物峰，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量限2.5μg/kg，精密度、回收率均符合檢測(cè)要求。根據(jù)測(cè)量的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的四環(huán)素量，在股骨骨組織灌胃后48-72h四環(huán)素可達(dá)最高峰，以后不再增加。在骨髓組織中灌胃后12h達(dá)到最高峰濃度，以后濃度逐漸減小。熒光顯微鏡觀察72h后熒光強(qiáng)度最高，以后不再增加。
　　結(jié)論:四環(huán)素在大鼠股骨骨組織中48-72h即可達(dá)到最大濃度，并趨于穩(wěn)定。在骨髓組織中12h達(dá)到峰濃度，以后濃度逐漸減小。
　　第三部分、

9、四環(huán)素誘導(dǎo)靶向pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體對(duì)GIOP大鼠的治療效果
　　目的:建立大鼠GIOP模型，研究四環(huán)素誘導(dǎo)靶向pTRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒載體對(duì)GIOP大鼠的治療作用。
　　方法:32只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。對(duì)照組（Control組）給予皮下注射生理鹽水5mg/kg/d，每周5次；激素組（Met組）皮下注射甲強(qiáng)龍5 mg/kg/d，每周5次，建立GIOP模型；四環(huán)素灌胃組

10、（Tet組）：在Met組基礎(chǔ)上給予四環(huán)素100 mg/kg/d灌胃，每周兩次；基因治療組（shPPARγ組）：在Met基礎(chǔ)上給予給予四環(huán)素100 mg/kg/d灌胃，12h后向股骨骨髓腔內(nèi)注射TRIPZ/PPARγ-shRNA慢病毒顆粒，每周兩次。8周后測(cè)量各組大鼠體重、血清生化指標(biāo)及股骨和L3椎體骨密度，制作骨切片，Micro-CT、HE染色觀察骨顯微結(jié)構(gòu)變化，比較各組大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)及骨生物力學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果:
　

11、?。?）體重方面：實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體重?zé)o明顯差異（P＞0.05），8周后Met組低于Control組（P＜0.01）；Tet組與Met組差異不明顯（P＞0.05）；shPPARγ組明顯高于Met組（P＜0.01）；
　?。?）血生化指標(biāo)：Met組總膽固醇、血清Ca明顯高于Control組（P＜0.01），血清ALP明顯低于Control組（P＜0.01）；Tet組血鈣明顯低于Met組（P＜0.01），總膽固醇、血清ALP與Met組無(wú)

12、明顯差異（P＞0.05）；shPPARγ組總膽固醇、血清Ca明顯低于Met組（P＜0.05），血清ALP明顯高于Met組（P＜0.05）；Met組、Tet組及shPPARγ組血磷均低于Control組（P＜0.05），但三者之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　?。?）股骨及L3椎體骨密度測(cè)定：Met組明顯低于Control組（P＜0.01）；Tet組、shPPARγ組骨密度較Met組明顯升高（P＜0.05）；且shPPARγ組明顯

13、高于Tet組（P＜0.05）。
　?。?）Micro CT分析：Met組與Control組比較骨小梁稀疏，測(cè)得骨密度顯著降低（P＜0.01）；Tet組與Met組比較股骨骨小梁無(wú)明顯變化（P＞0.05），但腰椎骨小梁增多，骨密度增加（P＜0.01）；shPPARγ組與Met組、Tet組比較，骨小梁增多，測(cè)得骨密度明顯升高（P＜0.01）。
　　（5）HE染色：Met組與Control組比較，骨小梁中的骨細(xì)胞數(shù)目減少，絕大部分細(xì)

14、胞排列雜亂，網(wǎng)狀連接破壞；Tet組較Met組骨小梁數(shù)目有增多，部分結(jié)構(gòu)變得整齊；shPPARγ組與Met組比較，骨小梁排列明顯緊密、有序，骨小梁數(shù)目明顯增多，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)。
　?。?）骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析：Met組%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th均較Control組下降，而Tb.Sp指標(biāo)較Control組上升（P＜0.01）；Tet組%Tb.Ar、Tb.N較Met組升高，Tb.Sp降低（P＜0.05），但Tb.Th與Met組無(wú)明

15、顯差異（P＞0.05）；shPPARγ組%Tb.Ar、Tb.N、Tb.Th指標(biāo)均較Met組上升，Tb.Sp降低（P＜0.01）；且shPPARγ組與Tet組比較所有指標(biāo)均有顯著性差異（P＜0.05）。
　?。?）骨生物力學(xué)分析：Met組較Control組最大載荷、最大擾度、最大應(yīng)力明顯降低（P＜0.01）；Tet組與Met組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；shPPARγ組三項(xiàng)指標(biāo)均高于Met組、Tet組（P＜0.05）