nHAC-PLA支架復合人VEGF-165基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細胞促進大鼠節(jié)段性骨缺損的血管生成和骨形成的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　 由嚴重創(chuàng)傷、腫瘤切除、先天性疾病、人工關節(jié)翻修術(shù)等各種原因引起的大段骨缺損在臨床上常見,其治療周期長,難度大,并發(fā)癥多,致殘率高,這無疑給患者增加了痛苦和花費。傳統(tǒng)的治療方法包括自體骨移植(游離或吻合血管)、異體骨移植及人工骨等。其中前者因不存在免疫排斥反應,且含具有骨誘導和骨轉(zhuǎn)導作用的干細胞及生成因子,仍被認為是中等量骨缺損治療的金標準。但當骨缺損區(qū)較大需要植入的骨量較多時自體骨往往不足,又增加了手術(shù)創(chuàng)傷和出

2、血,延長了手術(shù)時間,而且自體骨組織移植后能獲得血運而存活的功能細胞數(shù)量非常有限;異體骨移植及人工骨有排異反應、傳染疾病、爬行替代緩慢等諸多不足之處,不是理想的治療骨缺損的方法。
　　 目前,節(jié)段性骨缺損的治療策略主要有3類:①成骨誘導因子:如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等局部應用或與材料復合使用,②干細胞或祖細胞移植:將具有向成骨細胞分化潛能的種子細胞,如各種來源的間充質(zhì)干細

3、胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)等,移植于骨缺損處,③骨組織工程方法:基本模式為生物支架材料復合信號分子和/或干細胞。
　　 研究者最早將BMPs應用于動物實驗及臨床患者骨缺損的治療,是目前最肯定的具有誘導成骨作用的生長因子,BMP-2是目前已知該家族中誘導成骨能力最強的骨生長因子之一,但在節(jié)段性骨缺損區(qū)血管網(wǎng)的缺乏可能導致BMP-2在骨愈合過程中失去作用良機,影響其治療效果。雖然BMP-2有上調(diào)血管

4、內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達,從而可間接誘導血管新生的作用,但趙建軍等研究發(fā)現(xiàn),應用BMP-2治療骨缺損時,新生血管的密度在移植塊周邊區(qū)域較高,隨著向移植塊中央呈向心性減少,其認為BMP-2誘導的血管化進程取決于周圍的血運狀況,中央?yún)^(qū)域血運不充分,因而骨修復過程顯得較緩慢。骨缺損的修復是一個受多種細胞因子和生物信息調(diào)控的連續(xù)復雜的過程,其中缺損區(qū)的血管再生早于骨再生,

5、在沒有血運到達的缺損區(qū)不可能有成骨活動。因此血管再生是這一過程中的關鍵環(huán)節(jié),欲使大段骨缺損得以盡快修復,必須設法誘導血管網(wǎng)絡盡早重建。
　　 隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展,學者們也試圖應用這一方法來治療大段骨缺損,并做了大量有益的工作。多種支架結(jié)構(gòu)及干細胞已用于組織工程骨的研究中,然而同樣發(fā)現(xiàn)血管再生是影響其應用的關鍵環(huán)節(jié)之一。與器官移植不同的是,移植的器官有完善的血管網(wǎng)絡,吻合血管后可迅速恢復血供而成活并發(fā)揮生理功能。而移植的組

6、織工程骨則缺乏血管系統(tǒng),有證據(jù)表明,種子細胞的存活范圍在血供彌散的150～200μm范圍內(nèi),當組織團塊體積大于3mm3就不能依靠組織液的彌散支持細胞的生存,必須通過血管的再生來實現(xiàn)氧和營養(yǎng)物質(zhì)的供給,缺氧和營養(yǎng)匱乏將導致大量細胞在3天內(nèi)迅速壞死或凋亡?？梢娧苄律凸窃偕瑯邮菓媒M織工程技術(shù)治療骨缺損時的兩個最基本環(huán)節(jié)。體外構(gòu)建的組織工程化骨,植入體內(nèi)后同樣必須迅速建立充分的血供,才能保證組織工程化骨的成活及骨缺損的理想修復,這在修復

7、節(jié)段性骨缺損時顯得尤為重要。也就是說,完善的血管網(wǎng)絡是其存活并與宿主組織融為一體的基本的先決條件,組織工程化骨在體內(nèi)的血管化速度和程度是決定和制約其修復骨缺損療效的關鍵。
　　 血管生成是由多因素相互作用的復雜過程,基于人們對其機制的初步認識,這一領域的研究思路可概括為兩個方面:①在體外構(gòu)建組織工程化骨的同時,構(gòu)建人工網(wǎng)狀脈管系統(tǒng),然后再植入體內(nèi)修復骨缺損。②在缺損局部合理使用有利于血管生成的細胞因子或/和細胞。第一種方法難度較

8、大,操作復雜。合理應用促血管生成的生長因子如VEGF等對血管新生有較好的作用。VEGF是最主要的血管生長調(diào)節(jié)因子,在誘導血管再生方面應用最多。VEGF是血管內(nèi)皮細胞的特異性有絲分裂原,血管再生過程中其介導內(nèi)皮細胞遷移、增殖以構(gòu)建新生血管的管狀結(jié)構(gòu)。VEGF還能活化EPCs,并改善EPCs的功能。近期研究還表明,VEGF可能是骨骼發(fā)育、骨血管發(fā)生、骨折愈合過程中重要的調(diào)節(jié)因子,具有多方面的生物學功能,包括調(diào)節(jié)成骨細胞和軟骨細胞的分化、成骨

9、細胞的活性、具有促進成骨細胞增殖的絲裂原作用、誘導間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的作用等。VEGF-165是VEGF-A中最多見、成血管作用最顯著的一種異構(gòu)體。但應用VEGF不足之處在于和材料復合后生物活性大大降低,而且VEGF局部含量不易調(diào)控,含量低時效果有限,而高含量的VEGF作用有誘發(fā)血管瘤、水腫、低血壓和潛在腫瘤生長等危險。而應用基因治療的方法可巧妙的解決這一矛盾,既可使VEGF維持在治療水平,又可使其在一定時期內(nèi)持續(xù)表達,從而更理

10、想的促進血管新生。
　　 自Asahara于1997年發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)并證實其有成血管作用后,許多學者對其進行了大量的研究。EPCs能靶向遷移至缺血或血栓部位,促進并參與新生血管的形成,它還分泌多種促進新生血管生長的因子,如表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,H

11、GF)、IL-8、Ang-1和VEGF等,從而調(diào)節(jié)新生血管形成,在心腦血管疾病、四肢缺血性疾病、生物工程材料等諸多領域有著廣闊的研究和應用前景,而將其應用在節(jié)段性骨缺損的修復則鮮有報道。研究證實,內(nèi)皮祖細胞可被多種載體所攜帶的基因所轉(zhuǎn)染,從而增強其治療效果,該細胞在骨組織工程中的應用尚未見文獻報導。
　　 因此我們設想,以攜帶具有明顯成血管和成骨作用的VEGF-165基因的腺相關病毒轉(zhuǎn)染骨髓來源的EPCs,檢測目的基因的表達。然

12、后將VEGF-165基因修飾的EPCs與清華大學自主開發(fā)研制的納米人工骨(nHAC/PLA)材料復合以構(gòu)建組織工程骨,觀察其在治療大鼠股骨節(jié)段性骨缺損中對血管生成和成骨的影響,從而評價其效果。
　　 目的:將人VEGF-165基因轉(zhuǎn)染的大鼠內(nèi)皮祖細胞(EPCs)種植于納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸[nano-Hydroxyapatite/Collagen/Poly(L-LacficAcid),nHAC/PLA]支架以構(gòu)建組織工程骨

13、,并探討其在修復大鼠股骨節(jié)段性骨缺損中促進血管新生及新骨形成的作用。
　　 方法:
　　 本實驗包括體內(nèi)試驗和體外試驗兩部分,其中體外試驗方法如下:
　　 1.EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:無菌條件下取3周齡的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠的四肢長骨,以中性磷酸緩沖液(PBS)反復沖洗松質(zhì)骨和髓腔,將骨髓細胞懸液加于密度為1.083的Percoll分離液中,離心20～30分鐘后吸取小心兩層液體之間云霧

14、狀細胞層,以添加胎牛血清(FBS)的EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng),并加入多種生長因子以利于擴增。傳代后于不同時期用免疫組化方法行標志分子CD133、CD34和VEGFR-2鑒定,以低密度脂蛋白吞噬(LDL)和荊豆凝集素-1(UEA-1)結(jié)合實驗進行功能鑒定。
　　 2.基因轉(zhuǎn)染:以Ad5-hVEGF165-EGFP轉(zhuǎn)染EPCs,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達以推測目的基因轉(zhuǎn)染是否成功,并分別用RT-PCR和Western-Blot

15、在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯兩個水平上檢測目的基因的表達。
　　 3.基因修飾的EPCs與nHAC/PLA支架復合:將種子細胞種植在經(jīng)FN預孵過夜的支架材料上,于不同的時間點以掃描電鏡(SEM)觀察細胞在支架內(nèi)的生長狀態(tài),并以MTT法檢測種子細胞(hVEGF-165基因轉(zhuǎn)染的EPCs組和空載病毒轉(zhuǎn)染的EPCs組)在支架內(nèi)的增殖情況。
　　 體外試驗部分包括:
　　 1.大鼠股骨節(jié)段性骨缺損模型的制作和組織工程骨的植入:將

16、80只體重約400g的雄性SD大鼠隨機分為4組,在股骨中1/3處制作長約5mm的節(jié)段性骨缺損模型,分別移植hVEGF165/EPCs-nHAC/PLA(groupA,n=20)復合物、空白載體轉(zhuǎn)染的EPCs-nHAC/PLA(groupB,n=20)、EPCs-nHAC/PLA(groupC,n=20)或nHAC/PLA支架(groupD,n=20)。
　　 2.骨缺損修復和成血管效果的檢測:于不同的時間點行放射學Seeherm

17、an評分、HE染色進行組織學觀察,以評價各植入物在骨缺損處的成骨能力。并行組織切片的CD34免疫組化染色,在鏡下計數(shù)微血管密度,以評價各植入物的成血管效果。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)鑒定從大鼠骨髓分離培養(yǎng)的細胞為EPCs,表達標志性分子CD133、CD34和VEGFR-2;并能吞噬DiI標記的低密度脂蛋白,結(jié)合FITC標記的UEA-1而被雙染。
　　 基因轉(zhuǎn)染6小時后熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達,經(jīng)RT-PCR

18、和WesternBlot檢測有目的基因表達,且在所檢測的時間內(nèi)表達逐漸增高。
　　 與nHAC/PLA支架復合后,SEM表明其在纖維連接蛋白(FN)預孵過的支架材料微孔內(nèi)表面粘附、生長良好,接種2小時后開始伸出絲狀偽足,并逐漸表現(xiàn)為梭形或是鵝卵石樣外觀,隨著時間推移,偽足逐漸增多,在一些視野中尚可見細胞通過偽足相互連接。復合后24小時,這些細胞在支架內(nèi)增殖并經(jīng)孔隙相互橋接。
　　 MTT實驗顯示在支架內(nèi)增殖好,隨時間的推

19、移,細胞數(shù)目持續(xù)增加。復合后2、4、6天時hVEGF-165基因轉(zhuǎn)染的EPCs組的平均吸光度分別為:0.36±0.03vs0.52±0.04vs0.73±0.04,P均＜0.001。在相同時間點,空載病毒轉(zhuǎn)染的EPCs組的平均吸光度分別為:0.32±0.13vs0.49±0.08vs0.71±0.05,P均＜0.001。在同一時間點兩組比較無統(tǒng)計學意義,P均＞0.05。
　　 將組織工程骨植入大鼠股骨節(jié)段性骨缺損處后,不同時間點

20、的影像學分析表明,術(shù)后第6周,A組骨缺損區(qū)內(nèi)有大量新骨形成,密度較高,并可見部分皮質(zhì)連續(xù);B和C組的骨缺損區(qū)有較多新骨形成,密度較低,皮質(zhì)不連續(xù);D組的缺損區(qū)新骨形成少。第12周,A組骨缺損區(qū)完全修復,皮質(zhì)連續(xù),大多可見髓腔再通;B和C組有大量新骨形成,密度增高,皮質(zhì)部分連續(xù),少數(shù)可見髓腔再通;D組缺損區(qū)新骨形成較多,未見骨皮質(zhì)相連。骨缺損處的放射學評分在A組最高,B和C組高于D組,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 骨缺損處組織學分析顯

21、示,在術(shù)后3周時,A組宿主骨之間纖維組織增生明顯,少量炎性細胞浸潤,可見少量軟骨生成;6周時,A組新生骨較成熟,在支架的孔隙中有大量的新骨形成,支架降解較明顯,但骨髓腔尚無再通;第12周時,A組的骨缺損區(qū)幾乎完全修復,骨小梁成熟,皮質(zhì)連續(xù),可見較多的板層骨,大多可見髓腔再通,支架幾乎完全降解。
　　 術(shù)后3周時,各組的平均微血管密度分別為:A組14.99±1.52、B組7.39±0.69、C組7.16±0.79、D組5.53±0

22、.59,術(shù)后6周時,各組的平均微血管密度分別為:A組10.36±1.21、B組6.02±0.61、C組5.85±0.93、D組4.44±0.67,術(shù)后9周時,各組的平均微血管密度分別為:A組9.32±0.84、B組5.09±0.62、C組4.83±0.54、D組3.77±0.50,差異有統(tǒng)計學意義;組織學顯示新骨形成及支架降解在A組最明顯,B和C組優(yōu)于D組。
　　 結(jié)論:
　　 hVEGF-165基因轉(zhuǎn)染的大鼠EPCs與