大鼠牙源性細胞復合Nhac-PLA形成牙體組織-骨復合體樣結構及ADAM28基因作用的研究.pdf

1、種子細胞、生物支架、生長因子和微環(huán)境并稱為組織工程的四要素。組織工程牙是將從成牙組織中分離的生物活性細胞“種植”到載體支架上,并提供細胞增殖和分化的生長因子微環(huán)境,在體外或體內(nèi)植入形成有活性的牙齒樣結構和牙齒。制備適宜的支架材料,尋找種子細胞培養(yǎng)的最優(yōu)條件,探索最佳的生長因子或生長因子組合,是組織工程牙研究的方向。生長因子的開發(fā)和合理運用是促進種子細胞再生潛力發(fā)揮的重要因素之一,現(xiàn)今國內(nèi)外有關生長因子單獨作用于細胞.支架復合體的研究比較

2、普遍,但兩種或多種因子復合應用的效果尚未見詳細報道.納米羥基磷灰石-膠原/聚乳酸(nanometer hydroxyapatite-collagen/polylactic acid,nHAC/PLA)生物支架是仿生納米級植骨材料,具有良好的組織相容性、優(yōu)異的生物活性、高效的骨誘導性及可降解性.本研究首次將不同組合生長因子bFGF+IGF1、TGF-β1+BMP4、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4分別誘導大鼠牙源性上皮細胞(rD

3、ECs)、間充質(zhì)細胞(rDMCs)后分層接種于nHAC/PLA三維支架上,移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi),以誘導形成牙體組織-骨復合體樣結構,并對其進行鑒定分析,期望為頜骨缺損及牙齒缺失的再生修復提供可行性依據(jù)。
　　 牙齒發(fā)育是兩種相鄰組織-外胚上皮和神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)相互作用的結果,呈時空變化的基因調(diào)控在牙胚發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵作用,調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡,決定牙胚的發(fā)育進程。金屬蛋白酶解離素28(a disintegrin an

4、dmetalloprotonase28,ADAM28)是定位于細胞表面、擁有蛋白水解和黏附特性且具備自身催化活性的的跨膜分泌型糖蛋白,是從先天性牙根發(fā)育不良(congenitalhypoplasia of tooth root,CHTR)患者的差異表達基因中篩選出來的可能致病基因之一,有關其在牙源性間充質(zhì)干細胞中的表達分布及作用機理尚未見報道。本研究應用免疫學、細胞生物學和分子生物學技術,對ADAM28在人牙周膜干細胞(human pe

5、riodontal ligament stem cells,HPDLSCs)、人牙髓干細胞(human dentalpulp stem cells,HDPSCs)中的分布特征及對兩類細胞生物學特性的影響及可能的調(diào)控機制進行了初步探討。全文共分三部分,主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　 第一部分大鼠牙源性細胞復合nHAC/PLA支架體內(nèi)形成牙體組織-骨復合體樣結構的研究
　　 目的:探討經(jīng)不同組合生長因子誘導的大鼠牙源性上皮細

6、胞、間充質(zhì)細胞復合nHAC/PLA支架體內(nèi)形成牙體組織-骨復合體樣結構的能力。
　　 方法:
　　 1.應用酶消化法和差速消化法分離培養(yǎng)大鼠牙源性上皮細胞((rat dental epithelialcells,rDECs)和牙源性間充質(zhì)細胞(rat dental mesenchymal cells,rDMCs),經(jīng)cytokeratin、vimentin免疫熒光染色鑒定其來源。
　　 2.應用組織學染色(茜素紅

7、、ALP鈣-鈷法)檢測礦化液誘導下rDMCs的成骨特性。應用免疫組化染色、Real-time PCR和western blot檢測rDMCs在不同組合因子bFGF+IGF1(組①)、TGF-β1+BMP4(組②)、bFGF+IGF1+TGF-β1+BMP4(組③)誘導下CAP、DSPP、OCN、OPN的表達差異。
　　 3.應用四唑鹽比色法(MTT)檢測不同因子組合誘導后rDMCs的增殖活性,酶動力學法檢測總蛋白和ALP值,羅式

8、診斷分析法和放射免疫分析法分別檢測rDMCs上清液內(nèi)鈣、磷和骨鈣素濃度。
　　 4.應用掃描電鏡觀測rDECs、rDMCs分層復合nHAC/PLA支架后的生物相容性.
　　 5.將各組細胞-支架復合物移植裸鼠皮下3月、5月后分別取材,應用H&E、甲苯胺藍、Goldner三色和免疫組化染色檢測移植物形成牙體組織.骨復合體樣結構的能力。
　　 結果:
　　 1.成功分離培養(yǎng)、鑒定大鼠牙源性上皮細胞和問充質(zhì)細胞

9、,經(jīng)礦化液誘導后的rDMCs鈣結節(jié)和ALP染色陽性.組①、②中CAP、OCN、DSPP、OPN mRNA和蛋白的表達水平均顯著高于空白對照組④(未加因子的DF12培養(yǎng)液),其中組①CAP、OCN和組②DSPP、OPN的表達水平最高。
　　 2.組①的OD值在第4d、7d顯著高于其他3組,并在第4d達到峰值。組①、②、③在第7d的總蛋白和ALP值均顯著高于對照組④,以組②表達最高。4組的鈣、磷濃度均在第10d達最高值,在各時間點,

10、組①的鈣、磷濃度顯著高于其他3組。組②的骨鈣素(OCN)在第4d達到峰值,同時4組均在第7d達最低值,其中組③在第7d的骨鈣素含量最低。
　　 3.掃描電鏡顯示:rDECs、rDMCs復合nHAC/PLA共培養(yǎng)5d后,橢圓形的rDECs和長梭形的rDMCs胞體充分伸展,胞質(zhì)中膠原纖維和基質(zhì)分泌豐富,細胞與支架相互交織成網(wǎng)狀。10d后,rDECs、rDMCs胞質(zhì)中基質(zhì)分泌更加豐富,覆蓋部分細胞,并與支架相融合。
　　 4.

11、細胞-支架復合物移植后3月,組①、②、③在細胞.支架接觸部位均發(fā)現(xiàn)類骨質(zhì)、新生成熟骨和血管形成,并有OCN、OPN的陽性表達。組②TGF-β1+BMP4的促成骨作用最強,可見布滿骨髓基質(zhì)細胞的骨髓腔。空白對照組④沒有新生骨形成,僅有少量膠原纖維和血管。移植后5月,組①、③均形成沒有髓腔的牙根樣結構,部分區(qū)域有DSPP、DMP1、CAP的表達。組②形成周邊有新生骨、中央有單根牙體樣組織,內(nèi)有髓腔樣結構(含有牙髓樣組織和血管),并有DSPP

12、、DMP1、OPN、OCN在髓腔內(nèi)壁牙本質(zhì)基質(zhì)、部分牙髓樣組織和血管內(nèi)的陽性表達,ameloblastin、CAP分別在釉質(zhì)樣、牙骨質(zhì)樣組織中表達陽性?？瞻讓φ战M④形成新生骨,并有OCN的強陽性表達,但未見形成牙體樣結構。
　　 結論:
　　 1.rDMCs經(jīng)礦化液誘導后具有成骨特性。組①bFGF+IGF1可顯著促進rDMCs的增殖活性(第4d)和CAP、OCN的表達,加速rDMCs向成牙骨質(zhì)細胞、成骨細胞的分化和基質(zhì)礦

13、化(第4d),升高細胞外液的鈣、磷離子濃度(第10d).組②TGF-β1+BMP4能顯著提高OCN、DSPP、OPN的分泌水平(第4d),促進rDMCs的總蛋白合成和ALP活性(第7d),提示TGF-β1+BMP4可加速rDMCs向成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞、成牙本質(zhì)細胞分化與骨基質(zhì)、牙本質(zhì)基質(zhì)的礦化,顯示其成骨趨向.組③則顯著抑制OCN的分泌(第7d),降低rDMCs向成骨細胞的分化速度,提示4種因子之間并不具備顯著的協(xié)同作用。
　

14、　 2.rDECs+rDMCs復合nHAC/PLA支架后增殖、分化旺盛,生物相容性良好。
　　 3.經(jīng)TCF-β1+BMP4誘導的rDECs+rDMCs-nHAC/PLA體內(nèi)移植物的促成骨和成牙作用最強,移植后5月形成了牙體組織-骨復合體樣結構。
　　 第二部分 ADAM28基因對人牙周膜干細胞增殖、分化和凋亡特性的影響
　　 目的:探討ADAM28對人牙周膜干細胞(HPDLSCs)增殖、分化、凋亡等生物學特性

15、的影響和可能的作用機制.
　　 方法:
　　 1.利用酶聯(lián)合消化法(typeⅠcollagenase+dispase)原代培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞,間接免疫磁珠法加以分離純化,經(jīng)免疫熒光染色鑒定HPDLSCs的來源。
　　 2.應用基因重組技術構建并鑒定ADAM28真核表達質(zhì)粒,經(jīng)脂質(zhì)體介導轉染HPDLSCs48h后,應用免疫熒光、RT-PCR和western blot檢測ADAM28在HPDLSCs中的表達水平。

16、
　　 3.將經(jīng)過全硫代修飾及FITC熒光標記的ADAM28反義核酸(antisenseoligodeoxynucleotide,AS-ODN)及和正義對照S-ODN轉染HPDLSCs48h后,應用免疫熒光、RT-PCR和western blot檢測轉染效率和封閉效率。
　　 4.將成功構建的ADAM28真核表達質(zhì)粒、空載體pcDNA3.1(+)、AS-ODN、S-ODN同時轉染HPDLSCs,應用四唑鹽比色法(MTT)

17、、流式細胞術(flow cytometry,FCM)、酶動力學法、免疫細胞化學和western blot研究各組對HPDLSCs增殖、分化、凋亡的影響并分析可能的作用機制。
　　 結果:
　　 1.成功獲得STRO-1(+)的HPDLSCs,證明是來源于中胚層的間充質(zhì)干細胞。
　　 2.成功克隆ADAM28基因的編碼區(qū)全長2327bp,構建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ADAM28；并經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定

18、和核苷酸序列分析正確無誤。將ADAM28真核質(zhì)粒轉染HPDLSCs48h后,細胞胞質(zhì)強陽性表達ADAM28蛋白,可與抗ADAM28蛋白的抗體發(fā)生特異性結合,在轉錄和蛋白水平證明ADAM28在HPDLSCs內(nèi)能被正確地翻譯、表達。
　　 3.ADAM28 AS-ODN的轉染效率和封閉效率較高,可有效抑制HPDLSCs內(nèi)ADAM28 mRNA和蛋白的表達。
　　 4.ADAM28真核質(zhì)粒轉染后可顯著促進HPDLSCs的增殖并

19、抑制其分化,ADAM28AS-ODN則顯著抑制HPDLSCs的增殖并促進其分化,下調(diào)HPDLSCs內(nèi)CAP的表達水平并誘導HPDLSCs的凋亡.
　　 結論:ADAM28真核表達質(zhì)粒通過激活ADAM28基因的類金屬蛋白酶功能域,發(fā)揮其金屬蛋白酶的催化活性,裂解基質(zhì)蛋白、改建組織結構,有效調(diào)控細胞的增殖和分化.ADAM28 AS-ODN通過參與細胞凋亡副反饋機制,并與其它調(diào)控基因、基質(zhì)蛋白等協(xié)同作用,平衡細胞的增殖、分化和凋亡.<

20、br>　　 第三部分 ADAM28基因對人牙髓干細胞生物學功能的影響
　　 目的:探討ADAM28基因對人牙髓干細胞(HDPSCs)生物學功能的影響和可能的調(diào)控機制。
　　 方法:
　　 1.應用酶聯(lián)合消化法(typeⅠcollagenase+dispase)原代培養(yǎng)人牙髓細胞,間接免疫磁珠法分離純化,經(jīng)免疫熒光染色鑒定HDPSCs的來源。
　　 2.將ADAM28真核質(zhì)粒、AS-ODN轉染HDPSCs

21、48h,經(jīng)免疫熒光、RT-PCR和western blot檢測轉染效率和各組ADAM28的表達水平.
　　 3.采用MTT、FCM、酶動力學法、免疫細胞化學和western blot檢測ADAM28真核質(zhì)粒、AS-ODN對HDPSCs增殖、分化和凋亡的影響。
　　 結果:
　　 1.成功獲得STRO-1(+)的HDPSCs,證明是來源于中胚層的間充質(zhì)干細胞。
　　 2.ADAM28真核質(zhì)粒轉染HDPSCs

22、48h后,獲得了具有生物學活性的ADAM28真核表達產(chǎn)物,在轉錄、翻譯和蛋白水平證明ADAM28在HDPSCs內(nèi)能被正確地表達.ADAM28 AS-ODN能顯著促進HDPSCs內(nèi)ADAM28 mRNA和蛋白的表達,發(fā)揮明顯的負向調(diào)控作用。
　　 3.ADAM28真核質(zhì)粒能顯著提高HDPSCs內(nèi)ALP和DSPP的分泌活性,即促進HDPSCs多向分化和基質(zhì)礦化,抑制HDPSCs的增殖并誘導其凋亡。ADAM28AS-ODN則顯著促進H

23、DPSCs的增殖并抑制其分化。
　　 結論:ADAM28參與HDPSCs增殖、分化、凋亡的網(wǎng)絡調(diào)控,今后可將其獨特的表達特性應用于基因治療CHTR導致的牙根部牙本質(zhì)發(fā)育缺陷和牙根形態(tài)異常,期望為該病的臨床治療提供新的思路。
　　 本研究應用組織工程胚層重組技術,將不同因子組合誘導的大鼠牙源性上皮細胞+間充質(zhì)細胞-nHAC/PLA復合物移植裸鼠體內(nèi),其中TGF-β1+BMP4誘導組形成了牙體組織-骨復合體樣結構,為體內(nèi)牙齒