牙髓干細(xì)胞形成牙體組織能力及其制備嵌合體牙齒的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙齒組織工程中局部誘導(dǎo)微環(huán)境的建立主要是通過(guò)支架材料或單因子誘導(dǎo)的方式，來(lái)促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的分化。由于牙齒發(fā)育的微環(huán)境異常復(fù)雜，涉及到上皮-間充質(zhì)相互作用以及多種基質(zhì)成分、礦物離子、生長(zhǎng)因子的參與，單純依靠支架材料或某幾種生長(zhǎng)因子等非生理誘導(dǎo)方式局限性較明顯，不能滿足組織工程化牙齒的形態(tài)發(fā)生要求。本研究擬通過(guò)模擬牙髓干細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境，以重組微環(huán)境的方式來(lái)調(diào)控牙髓干細(xì)胞的分化和形態(tài)發(fā)生，并在此基礎(chǔ)上，嘗試?yán)醚浪韪杉?xì)胞研制同種異體“

2、嵌合體牙齒”，以期為組織工程化牙齒最終的臨床應(yīng)用探尋一條新的研究途徑。 所取得的主要研究結(jié)果如下： 1、組織工程化牙齒異位再生環(huán)境的篩選和驗(yàn)證比較了出生后4 d 的封閉群SD 仔鼠磨牙牙胚器官，在同種異體宿主體內(nèi)不同部位的生長(zhǎng)發(fā)育情況，結(jié)果表明腎被膜下的牙胚發(fā)育狀況接近正常；進(jìn)一步將相關(guān)的牙齒組織塊移植至腎被膜下，同樣生長(zhǎng)發(fā)育良好；單獨(dú)將牙乳頭細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行腎被膜下移植，可以形成牙尖樣的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體。另外，我們還比較了傳

3、代前、后的牙胚細(xì)胞團(tuán)在腎被膜下構(gòu)建組織工程化牙齒的可行性，結(jié)果表明：原代牙胚細(xì)胞團(tuán)體內(nèi)可發(fā)育成典型的牙胚樣結(jié)構(gòu)，而第二代牙胚細(xì)胞團(tuán)僅形成極少量的釉質(zhì)，覆蓋在牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體表面。上述結(jié)果證實(shí)腎被膜下環(huán)境有利于牙胚及其相關(guān)組織、細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育。在腎被膜下的生長(zhǎng)環(huán)境中，出生后的牙乳頭細(xì)胞、牙胚細(xì)胞可分別再現(xiàn)牙齒間充質(zhì)、牙胚早期的發(fā)育模式，說(shuō)明牙齒形態(tài)發(fā)生所需的遺傳信息是儲(chǔ)存在離散后的單個(gè)牙源性細(xì)胞中的。 2、牙胚細(xì)胞誘導(dǎo)牙髓干

4、細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證牙胚細(xì)胞所提供的發(fā)育微環(huán)境是否適合成體牙髓干細(xì)胞的增殖、分化，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)三種不同的培養(yǎng)方式：牙胚細(xì)胞條件液、分層培養(yǎng)、混合培養(yǎng)，觀察牙胚細(xì)胞對(duì)牙髓干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。結(jié)果顯示：牙髓干細(xì)胞在與牙胚細(xì)胞條件液培養(yǎng)、分層培養(yǎng)的情況下，可向功能性成牙本質(zhì)細(xì)胞譜系分化，誘導(dǎo)分化后的牙髓干細(xì)胞團(tuán)移植至腎被膜下，形成了規(guī)則的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體結(jié)構(gòu)。而牙胚細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞混合培養(yǎng)方式不能提供了良好的促增殖、促分化的誘導(dǎo)環(huán)境，以致

5、誘導(dǎo)后的牙髓干細(xì)胞不能形成典型的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體。 上述結(jié)果提示牙胚細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞非接觸式培養(yǎng)時(shí)，所提供的可溶性信號(hào)分子，有利于牙髓干細(xì)胞的牙向分化、牙本質(zhì)形成；而接觸式培養(yǎng)條件下牙胚細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)蛋白以及不溶性表面分子，可能對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖起抑制作用，進(jìn)而影響了其牙向分化的可持續(xù)性。 3、牙髓細(xì)胞對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖分化的影響為驗(yàn)證來(lái)自成體牙髓細(xì)胞的微環(huán)境能否促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖、分化，本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法結(jié)合組織

6、塊法，獲取原代牙髓細(xì)胞，與STRO-1+的牙髓干細(xì)胞以三種方式：條件液、分層培養(yǎng)、混合培養(yǎng)進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果表明： 缺少上皮信號(hào)的成體微環(huán)境不能有效地誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞的牙向分化和形態(tài)發(fā)生，但可明顯促進(jìn)其增殖活性。提示成體微環(huán)境中缺少促進(jìn)牙髓干細(xì)胞牙向分化的啟動(dòng)信號(hào)，但成體微環(huán)境中生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞表面分子等對(duì)牙髓干細(xì)胞的促增殖效應(yīng)明顯。 4、用牙髓干細(xì)胞制備嵌合體牙齒為進(jìn)一步驗(yàn)證牙胚細(xì)胞的誘導(dǎo)作用是來(lái)自其中的上皮

7、還是間充質(zhì)成分，本實(shí)驗(yàn)將取自不同個(gè)體的大鼠切牙根尖蕾細(xì)胞、牙乳頭細(xì)胞分別與STRO-1+牙髓干細(xì)胞復(fù)合形成細(xì)胞團(tuán)重組體，腎被膜下移植，結(jié)果顯示根尖蕾細(xì)胞-牙髓干細(xì)胞嵌合體在體內(nèi)形成典型的牙冠樣結(jié)構(gòu)；牙乳頭細(xì)胞-牙髓干細(xì)胞嵌合體形成的含骨樣牙本質(zhì)和牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中，PKH26 標(biāo)記的牙髓干細(xì)胞并未直接參與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成，說(shuō)明在牙胚細(xì)胞誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞牙向分化過(guò)程中，是牙源性上皮成分起了決定性作用。 在與非牙源

8、性STRO-1+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞嵌合成牙的比較研究中，我們發(fā)現(xiàn)：根尖蕾細(xì)胞能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞譜系分化，但根尖蕾細(xì)胞-骨髓基質(zhì)干細(xì)胞重組體在腎被膜下，僅發(fā)育成不典型的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體，無(wú)釉質(zhì)形成。提示在嵌合體牙齒研究中，牙源性成體干細(xì)胞比非牙源性成體干細(xì)胞更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。 當(dāng)牙髓干細(xì)胞與根尖蕾細(xì)胞按不同比例進(jìn)行體內(nèi)重組時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)：上皮細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞的比例可影響嵌合體牙齒的形態(tài)發(fā)生，只有在1:1 細(xì)胞比情況下，