猴-鼠嵌合體動(dòng)物模型的建立及表皮干細(xì)胞可塑性的研究.pdf

1、目的: 為研究靈長(zhǎng)類表皮干細(xì)胞是否具有可塑性，建立猴-鼠嵌合體動(dòng)物模型來觀察恒河猴表皮干細(xì)胞的在嵌合體中存活、分布，建立囊胚注射后體外培養(yǎng)系統(tǒng)來觀察人表皮干細(xì)胞在注射早期囊胚中的細(xì)胞遷移和基因表達(dá)的改變. 方法: 1.表皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化和鑒定分別采用消化法培養(yǎng)恒河猴、人的表皮干細(xì)胞，用IV膠原吸附法純化表皮干細(xì)胞，純化后的細(xì)胞采用細(xì)胞免疫熒光組織雙標(biāo)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期

2、檢測(cè)等方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 2.囊胚顯微注射法獲得嵌合體胚胎和動(dòng)物再次用顯微注射針分選表皮干細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記人表皮干細(xì)胞后進(jìn)行囊胚顯微注射，注射后囊胚在體外進(jìn)行培養(yǎng)；恒河猴表皮干細(xì)胞直接進(jìn)行囊胚注射，注射后囊胚進(jìn)行子宮移植，獲得嵌合體胚胎和動(dòng)物。 3.注射后囊胚體外培養(yǎng)和細(xì)胞遷移、基因表達(dá)改變的觀察分別在注射后2、4、12、16、24小時(shí)將體外培養(yǎng)的囊胚收集，顯微鏡下進(jìn)行囊胚形態(tài)觀察、共聚焦顯微鏡囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)、表皮干

3、細(xì)胞遷移觀察以及利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)表皮干細(xì)胞Oct4、Nanog、K15、Integrinβ1基因表達(dá)的改變。 4.嵌合體胚胎和動(dòng)物的檢測(cè)對(duì)出生后的嵌合體動(dòng)物進(jìn)行表型觀察，用PCR方法檢測(cè)雄性恒河猴Y染色體的標(biāo)志基因SRY來觀察是否有恒河猴來源細(xì)胞的嵌合，用熒光原位雜交(FISH)方法來檢測(cè)恒河猴來源細(xì)胞在組織中的嵌合和分布。 結(jié)果: 1.體外培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞經(jīng)IV膠原分選后，表達(dá)表皮干細(xì)胞標(biāo)志蛋白K14、K

4、19和外胚層前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nestin，細(xì)胞周期檢測(cè)表現(xiàn)為慢細(xì)胞周期，G0/G1期細(xì)胞占80％以上，RT-PCR結(jié)果顯示分選后細(xì)胞表達(dá)K15、Integrinβ1而不表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志基因Oct4、Nanog。 2.通過囊胚顯微注射，進(jìn)行了360鼠·次的胚胎移植，成功獲得了猴鼠嵌合體成型胚胎8只和存活嵌合體動(dòng)物3只，獲得體外培養(yǎng)的注射后囊胚263個(gè)。 3.注射后囊胚在培養(yǎng)4h后，開始恢復(fù)囊胚腔，12h開始孵化，24h

5、注射組的胚胎具有較高的孵化效率，但是和對(duì)照未注射組比較，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和總細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異。注射的表皮干細(xì)胞在4h時(shí)大部分細(xì)胞遷出囊胚，少數(shù)滯留在囊胚里，16h時(shí)細(xì)胞數(shù)增多，可在滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)檢測(cè)到標(biāo)記的細(xì)胞，人表皮干細(xì)胞K15和Integrinβ1的基因分別在培養(yǎng)12h、4h后檢測(cè)不到，而直到24h也未能檢測(cè)到Oct4、Nanog基因的表達(dá)4.嵌合體存活小鼠在出生后發(fā)育、哺乳、和體型上與正常小鼠沒有什么差別，在成年后，體型較正常的小鼠稍

6、大；PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，分別在成型胚胎中和存活的小鼠中觀察到恒河猴表皮干細(xì)胞的嵌合現(xiàn)象，在死胎的器官中通過更靈敏的巢式PCR也可檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)；FISH檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嵌合體胚胎的肝臟組織切片中可以發(fā)現(xiàn)有恒河猴表皮來源細(xì)胞的嵌合現(xiàn)象。 結(jié)論: 1.IV膠原分選角質(zhì)細(xì)胞符合表皮干細(xì)胞的特性2.注射異源性成體干細(xì)胞后，小鼠囊胚能夠存活并正常發(fā)育3.靈長(zhǎng)類表皮干細(xì)胞可以在小鼠囊胚中存活，并能整合到滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)4.注射后培養(yǎng)早