成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可塑性的體外研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能 第一章體fl,誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為5羥色胺敏感性神經(jīng)元 目的：體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為具有神經(jīng)元表型和部分功能的細(xì)胞。 方法：將取自6-8周成年SD大鼠股、脛骨的細(xì)胞貼壁傳代培養(yǎng)至6-10代，采用有限稀釋法對(duì)細(xì)胞作單克隆純化。在全反式視黃酸預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后，HBSS洗去含血清培養(yǎng)液，換用改良的Woodbury長(zhǎng)時(shí)程神經(jīng)元誘導(dǎo)液培養(yǎng)細(xì)胞，3、6、9

2、、12、24、48、72、96小時(shí)后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；細(xì)胞免疫染色檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)絲M+H、5-羥色胺的表達(dá)；并用胞內(nèi)鈣代謝測(cè)定法測(cè)定誘導(dǎo)前后細(xì)胞對(duì)5-HT的功能反應(yīng)。 結(jié)果：改良神經(jīng)元誘導(dǎo)液處理3小時(shí)后，細(xì)胞開始表現(xiàn)神經(jīng)元的形態(tài)特征，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，形成收縮的雙極或多極胞體和細(xì)長(zhǎng)突起。細(xì)胞可以維持神經(jīng)元樣存活72小時(shí)以上。誘導(dǎo)5小時(shí)后，對(duì)免疫染色的細(xì)胞用DAPI進(jìn)行復(fù)染，92．4±6．9％的細(xì)

3、胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶。誘導(dǎo)24小時(shí)后，93．9±5．2％的細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物神經(jīng)微絲H。在給予5一羥色胺刺激時(shí)可以產(chǎn)生與神經(jīng)元相似的胞內(nèi)鈣離子峰，且免疫組化證實(shí)5-羥色胺1A受體在干細(xì)胞上表達(dá)微弱，但在分化后的神經(jīng)元中表達(dá)較強(qiáng)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)、細(xì)胞標(biāo)志物、功能幾方面顯示rMSCs可分化為5一羥色胺敏感性神經(jīng)元。 第二章體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓干細(xì)胞分化為上皮樣細(xì)胞 目的：將已成功誘導(dǎo)為5

4、-HT敏感性神經(jīng)元的單克隆rMSCs置于極性上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的滲透性濾膜上觀察其向上皮細(xì)胞方向分化情況。 方法：取同一單克隆來源的rMSCs按照2×lO5個(gè)細(xì)胞／0．45cm2的密度種在漂浮在培養(yǎng)液上的滲透性濾膜上(常用于極性上皮細(xì)胞的培養(yǎng))，置于37℃、5％C02的濕化孵箱中培養(yǎng)4天。將半透膜上細(xì)胞直接鏡下觀察或蘇木素染色冰凍切片觀察細(xì)胞形態(tài)變化；免疫熒光染色、RT-PCR、WesternBlotting檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物在不同水平的

5、表達(dá)情況；短路電流檢測(cè)細(xì)胞的電生理特性。 結(jié)果：蘇木素染色顯示rMSCs在生長(zhǎng)于滲透性濾膜上4天后形成了緊密的單層。免疫熒光染色顯示此生長(zhǎng)在滲透性濾膜上的單層細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白5&8。RT-PCR結(jié)果也顯示生長(zhǎng)在滲透性濾膜而不是生長(zhǎng)在培養(yǎng)瓶中的rMSCs表達(dá)上皮鈉通道(ENaC)、囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子(CFTR)和緊密聯(lián)結(jié)蛋白ZO—l的mRNA。但是，用WesternBlotting僅檢測(cè)到ZO一1的表達(dá)。短路電

6、流測(cè)定法顯示生長(zhǎng)在滲透性濾膜上的rMSCs來源細(xì)胞單層的電阻為30-50Ω，但對(duì)CFTR和ENaC的激動(dòng)劑或阻斷劑無反應(yīng)。 結(jié)論：極性上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件能誘導(dǎo)rMSCs向上皮樣細(xì)胞分化。這些上皮樣細(xì)胞表現(xiàn)上皮細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)部分上皮細(xì)胞標(biāo)志物，但不具有成熟上皮細(xì)胞離子通道的功能。 第二部分rMSCs來源的神經(jīng)元和上皮樣細(xì)胞可以通過去分化和再分化途徑相互轉(zhuǎn)變 目的：首先從功能上證實(shí)rMSCs來源的神經(jīng)元可

7、以被誘導(dǎo)去分化、增殖和再分化，然后研究干細(xì)胞來源的神經(jīng)元和上皮前體細(xì)胞能否在所建立的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)條件下通過去分化再分化實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)變。 方法：在誘導(dǎo)rMSCs分化為神經(jīng)元24小時(shí)后，換用含血清培養(yǎng)液，再過24小時(shí)后，按照2×lO5個(gè)細(xì)胞／0．45cm2的密度轉(zhuǎn)移至滲透性濾膜上培養(yǎng)4天。然后將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至有含血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，24小時(shí)后換為神經(jīng)元預(yù)誘導(dǎo)液，一天后傾去預(yù)誘導(dǎo)液并用HBSS清洗細(xì)胞后加入改良神經(jīng)元誘導(dǎo)液。繼續(xù)培養(yǎng)

8、24小時(shí)。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，胞內(nèi)鈣代謝法檢測(cè)細(xì)胞的功能改變。 結(jié)果：在rMSCs分化為神經(jīng)元24小時(shí)后，換用含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，所有的神經(jīng)元表型的細(xì)胞均恢復(fù)rMSCs形態(tài)。去分化的細(xì)胞增殖24小時(shí)后按照誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分化的濃度轉(zhuǎn)移至滲透性濾膜上，4天后細(xì)胞形成緊密單層并可測(cè)得與直接由rMSCs形成的細(xì)胞單層相似的跨上皮電壓、電阻和電流。將上皮樣細(xì)胞從滲透性濾膜上刮下種在培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，單個(gè)散在的上皮樣細(xì)胞可以被誘導(dǎo)去