聽覺剝奪動(dòng)物模型的建立及BDNF-TrKB與聽皮層可塑性的關(guān)系.pdf

1、目的:
　　 建立聽覺剝奪（auditorydeprivation，AD）的動(dòng)物模型，探索中樞聽覺系統(tǒng)發(fā)生可塑性變化的相關(guān)分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究了聽覺剝奪動(dòng)物模型中腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain-derivedneurotroficfactor，BDNF）及酪氨酸激酶受體B(tropomyosinreceptorkinaseB，TrkB)在聽皮層內(nèi)的表達(dá)變化，通過對(duì)聽皮層神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量的動(dòng)態(tài)觀察，揭示BDNF/TrkB信號(hào)通路

2、參與聽皮層可塑性調(diào)節(jié)的重要作用，為耳聾患者接受電子耳蝸植入甚至腦干植入提供重要的參考價(jià)值。
　　 方法:
　　 選取2周齡健康雄性SD大鼠，5％水合氯醛（8ml/kg劑量）經(jīng)腹腔注射麻醉，實(shí)驗(yàn)組行耳后切口雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)，對(duì)照組行雙側(cè)耳后切口并且打開聽泡，但不損毀耳蝸。采用聽性腦干反應(yīng)(auditorybrainstemresponse，ABR)測(cè)試裝置，分別于術(shù)前和術(shù)后對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的聽力閾值進(jìn)行檢測(cè)。分別于術(shù)后2

3、周、4周、6周和8周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行心臟灌注，取出完整大腦浸入4％多聚甲醛后固定24小時(shí)，二次取材后經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋，制成石蠟標(biāo)本;同時(shí)在與以上相同的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行眼球放血，斷頭處死，取雙側(cè)聽皮層腦組織至Trizol溶液內(nèi)保存于-80℃冰箱備用。利用蘇木精-伊紅（HemateinEosin，HE）染色及尼氏染色技術(shù)分別觀察神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量的變化，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)技術(shù)分別檢測(cè)BDNF和Trk

4、B的基因和蛋白在聽皮層內(nèi)的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.動(dòng)物模型的建立:通過耳后切口雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)可以建立穩(wěn)定可靠的聽覺剝奪動(dòng)物模型。術(shù)后2周對(duì)照組大鼠雙耳平均聽力閾值為20.21±4.29decibelsoundpressurelevel(dBSPL)，AD組雙耳平均聽力閡值為91.33±5.32dBSPL，兩組間比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.HE染色結(jié)果:正常神經(jīng)元體積較大，

5、形態(tài)不規(guī)則，胞漿豐富呈深紅色，細(xì)胞核大呈深藍(lán)色，耳蝸損毀動(dòng)物模型聽皮層的神經(jīng)元體積縮小，胞漿變得不豐富，核固縮，碎裂，甚至消失。
　　 3.尼氏染色和神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果:正常對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞體積較大，分布均勻，形態(tài)不規(guī)則，胞漿內(nèi)Nissl小體近胞膜處明顯。實(shí)驗(yàn)組可見神經(jīng)元體積大小不一，分布雜亂，Nissal小體崩解，有的僅在細(xì)胞周邊有少量殘余。聽覺剝奪導(dǎo)致聽皮層神經(jīng)元出現(xiàn)退化，隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，早期退化速度較慢，后期加快。

6、除2周組和4周組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)外，其余兩兩比較均有顯著差異(P＜0.05)。各AD組與同期對(duì)照組比較神經(jīng)元數(shù)量均減少，經(jīng)t檢驗(yàn)顯示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.聽皮層BDNF與TrkB蛋白表達(dá)變化:AD組及對(duì)照組聽皮層均有BDNF與TrkB的陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)定位在胞膜和軸突。耳蝸損毀術(shù)后聽皮層BDNF與TrkB蛋白有相似的表達(dá)變化趨勢(shì)，即術(shù)后2周降低，4周升高，之后又降低，峰值出現(xiàn)在術(shù)后4周。

7、對(duì)照組聽皮層BDNF與TrkB的表達(dá)在術(shù)后2周最多，之后下降并保持在一定水平。經(jīng)方差分析顯示，AD組各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各AD組與對(duì)照組比較，除6周組外，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 5.聽皮層BDNF與TrkB基因mRNA的表達(dá)變化:AD組大鼠聽皮層BDNF與TrkB的mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致:與對(duì)照組相比，2周組表達(dá)下降，4周增高，6周與對(duì)照組水平相當(dāng)，之后下降。除6周組外，各AD組

8、BDNF與TrkB的mRNA表達(dá)量與其對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 BDNF在正常大鼠聽皮層內(nèi)表達(dá)，出生后初期高表達(dá)，隨著發(fā)育過程呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，TrkB作為BDNF的“功能受體”，呈現(xiàn)與BDNF相同的變化趨勢(shì);雙側(cè)耳蝸損毀的大鼠，BDNF及TrkB的表達(dá)量在初期下降之后上升，到后期再次減少，且兩者的表達(dá)趨勢(shì)呈正相關(guān)，聽皮層內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量減少，早期較慢，后期加快。說明BDNF通過與功