組織蛋白酶K在牙體硬組織形成中的作用研究.pdf

1、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）于1995年首先被發(fā)現(xiàn)存在于兔的破骨細(xì)胞中。早先的研究認(rèn)為CTSK主要在破骨細(xì)胞中表達(dá)，并通過在酸性環(huán)境下降解Ⅰ型膠原、骨橋蛋白等骨基質(zhì)蛋白參與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。CTSK基因位于人類1號染色體，其突變將導(dǎo)致致密性成骨不全（pycnodysostosis）。其典型癥狀除骨密度增高、頻發(fā)骨折、指/趾骨末端溶骨等骨骼異常之外，通常還會表現(xiàn)有牙釉質(zhì)發(fā)育障礙、牙髓腔或根管閉鎖以及牙骨質(zhì)增厚等牙體

2、硬組織異常，但其機(jī)制尚不清楚，甚至目前尚未見到CTSK在牙齒發(fā)育過程中表達(dá)模式及作用的研究報道。考慮到骨組織和牙體硬組織（牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)）有著相似的成分及理化性質(zhì)，在骨改建過程中發(fā)揮重要作用的CTSK有可能在牙體硬組織發(fā)育過程中亦發(fā)揮重要作用。本課題以研究CTSK在牙齒發(fā)育過程中的表達(dá)模式為切入點(diǎn)，利用體外降解實(shí)驗(yàn)尋找CTSK在牙齒發(fā)育過程中可能的作用底物，構(gòu)建Ctsk基因敲除小鼠模型并分析其表型，并通過對CTSK基因突變臨床病

3、例的研究，來探索CTSK在牙體硬組織形成中的作用，為進(jìn)一步研究其在牙齒發(fā)育中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1)25只BALB/c小鼠（18天胎鼠和出生后1天、5天、10天、20天小鼠各5只），用1％戊巴比妥鈉行腹腔內(nèi)注射過量麻醉處死后解剖分離下頜骨，利用免疫組化染色觀察下頜磨牙（牙胚）中CTSK的表達(dá)情況；
　　2)利用釉基質(zhì)蛋白（Emdogain，EMD）酶譜實(shí)驗(yàn)（考馬斯亮藍(lán)染色），檢測不同pH值（pH=4.

4、5、pH=5.5和pH=8）、不同反應(yīng)時間（2h、6h、12h、24h、48h）和不同CTSK濃度（上樣量分別為0.015μg、0.045μg、0.075μg、0.105μg、0.15μg和0.225μg）條件下，CTSK對釉基質(zhì)蛋白的降解能力；
　　3)利用體外降解實(shí)驗(yàn)（銀染色），檢測不同酶/底物比和不同反應(yīng)時間（0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h）條件下，CTSK對釉原蛋白（AMELX）的降解能力；

5、　　4)委托上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Ctsk基因敲除小鼠模型；
　　5)利用體視顯微鏡和Micro CT初步觀察Ctsk基因敲除小鼠下頜骨和牙齒的形態(tài)與結(jié)構(gòu)；
　　6)通過病史采集、體格檢查、病理檢查、X線檢查、頜面部CBCT等檢查和CTSK基因測序?qū)?例致密性成骨不全患者進(jìn)行臨床研究和基因分析。
　　結(jié)果：
　　1)在小鼠磨牙牙胚發(fā)育過程中，從前成釉細(xì)胞到成熟晚期的成

6、釉細(xì)胞均表達(dá)CTSK，表達(dá)強(qiáng)度呈弱-強(qiáng)-弱的變化；
　　2)在牙本質(zhì)礦化階段的成牙本質(zhì)細(xì)胞中可以檢測到CTSK的強(qiáng)表達(dá)，并且這種表達(dá)一直持續(xù)到牙本質(zhì)形成的晚期；
　　3)通過EMD酶譜實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在pH=4.5的酸性環(huán)境中，CTSK能夠降解商品化的釉基質(zhì)蛋白，其酶解能力隨著作用時間和CTSK濃度的增加而增強(qiáng)；
　　4)通過體外降解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CTSK可以將釉原蛋白裂解為多個產(chǎn)物，其酶解能力隨著作用時間和CTSK濃度的增加而

7、增強(qiáng)；
　　5)成功構(gòu)建了Ctsk-/-小鼠模型，為研究CTSK在牙齒發(fā)育中的作用及作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)工具；
　　6)初步觀察到Ctsk-/-小鼠磨牙有類似于成熟不全型釉質(zhì)發(fā)育不全的表現(xiàn)，以及下頜第一磨牙髓室牙本質(zhì)增厚、髓室局部閉鎖等牙體硬組織異常表現(xiàn)；
　　7)通過體格檢查、影像學(xué)檢查、病理檢查等，發(fā)現(xiàn)該患者具有身材矮小、骨密度增高、鎖骨發(fā)育異常、雙手雙腳短小、指甲發(fā)育異常、指/趾骨末端溶骨、額骨膨隆、顴面部塌陷、上

8、下頜骨發(fā)育不良、下頜角變鈍、腭穹隆消失、上頜牙列缺損、下頜牙列缺失、牙骨質(zhì)增生、牙齒萌出異常、下頜頜骨骨髓炎等致密性成骨不全的典型癥狀；通過基因分析，明確了患者致密性成骨不全的診斷，發(fā)現(xiàn)了CTSK基因5號外顯子上的兩個復(fù)合雜合突變位點(diǎn)（p.Gly146Asp和p.Tyr203His）。
　　結(jié)論：本課題首次發(fā)現(xiàn)了CTSK表達(dá)于小鼠磨牙牙體硬組織形成相關(guān)細(xì)胞，首次揭示了CTSK在小鼠磨牙發(fā)育過程中的時空表達(dá)模式及CTSK能夠降解牙體

9、硬組織特異性蛋白——釉原蛋白等釉基質(zhì)蛋白的能力；成功構(gòu)建了Ctsk-/-小鼠模型，為進(jìn)一步研究CTSK在牙齒發(fā)育中的作用及作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)工具；并且首次觀察到Ctsk-/-小鼠磨牙具有釉質(zhì)發(fā)育不全、局部髓室閉鎖等牙體硬組織異常表現(xiàn)。與此同時，我們再一次證實(shí)CTSK基因突變所致的致密性成骨不全患者表現(xiàn)有包括牙齒發(fā)育異常在內(nèi)的多種牙齒相關(guān)表征。初步證實(shí)了CTSK在牙體硬組織形成過程中發(fā)揮作用，為進(jìn)一步揭示CTSK在牙體硬組織形成過程中的作