組織蛋白酶S活性調(diào)控小鼠缺血誘導(dǎo)的血管再生機(jī)制及冠心病患者血清中組織蛋白酶K的變化.pdf

1、組織蛋白酶S活性調(diào)控小鼠缺血誘導(dǎo)的血管再生機(jī)制
　　目的：組織蛋白酶 S（CatS）通過(guò)修飾/分解各種生物活性物質(zhì)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的生物活性。目前為止，組織蛋白酶中，組織蛋白酶L和K在病理性血管再生中的作用有報(bào)道，但是 CatS在血管形成，尤其在缺血性血管生成中表達(dá)及其作用尚無(wú)報(bào)道。研究CatS基因敲除是否影響缺血性血管再生及探明它的機(jī)制。本研究為尋找下肢缺血性疾病新治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　材料與方法：本研究利用制

2、備下肢缺血模型，觀察缺血缺氧對(duì)CatS的蛋白表達(dá)及其活性變化，明確其在缺血性血管再生的作用。應(yīng)用CatS基因敲除小鼠進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)血管再生相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的功能。在動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用基因沉默/轉(zhuǎn)染、免疫組織化學(xué)染色/免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)（FACS）、骨髓移植、免疫蛋白印跡（Western Blot）、主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)（Aortic Ring Asssay）等多種檢測(cè)方法揭示CatS在缺血

3、性血管再生中的作用。
　　結(jié)果：1.CatS基因敲除明顯抑制缺血性血管再生反應(yīng)。用激光多普勒超聲血流儀檢測(cè)下肢血流的動(dòng)態(tài)變化。觀察到術(shù)后即刻、術(shù)后1天血流明顯下降,術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù)，CatS基因敲除小鼠缺血下肢血流恢復(fù)明顯慢于正常對(duì)照組。用 CD31免疫染色重點(diǎn)分析了毛細(xì)血管的形成。觀察到 CatS基因敲除小鼠與正常對(duì)照組比較在缺血骨骼肌毛細(xì)血管形成明顯受阻，CatS基因敲除小鼠的毛細(xì)血管密度明顯低于正常對(duì)照組。2.組織

4、蛋白酶 S基因敲除明顯降低過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-Erk）、胰島素受體底物-2（IRS-2）、磷酸化絲氨酸-蘇氨酸激酶（p-Akt）、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）、磷酸化內(nèi)皮一氧化氮合酶（P-eNOS）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的蛋白表達(dá)。制備下肢缺血模型第4天采集樣本，做western Blot來(lái)檢測(cè)CatS基因敲除小鼠和野生型小鼠的各種蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：

5、CatS基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，缺血骨骼肌中PPAR-γ、IRS-2、P-Akt、P-Erk、P-P38MAPK、P-GSK、P-eNOS、VEGF的蛋白表達(dá)明顯降低。3.組織蛋白酶 S的siRNA組細(xì)胞的浸潤(rùn)、增殖和成小管化功能減退的機(jī)制與 PPARγ、p-Erk、IRS-2、p-Akt、p-p38MAPK、P-eNOS和 VEGF水平的降低有關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí) CatS在血管再生中的作用，利用基因沉默（siRNA），使CatS

6、的表達(dá)降低。為了證實(shí)這一結(jié)果我們用western Blot檢測(cè)CatS和CatK的活性。結(jié)果表明：CatS的siRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而對(duì)組織蛋白酶 K的表達(dá)無(wú)明顯影響。將 CatS的siRNA，轉(zhuǎn)染給人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，做 western來(lái)檢測(cè)與血管再生相關(guān)的各種蛋白表達(dá)。在這圖中可以看出CatS的siRNA組的PPARγ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、p-p38MAPK、p-GSK、p-eNOS、VEGF等與血管再生相關(guān)的

7、蛋白表達(dá)明顯降低。觀察細(xì)胞的增殖功能結(jié)果表明：CatS的siRNA組與正常對(duì)照組比較，增殖的細(xì)胞數(shù)明顯減少。進(jìn)一步研究與血管再生相關(guān)的成小管化功能。用CatS干預(yù)的RNA組與未處理的正常對(duì)照組相比，管腔形成明顯被抑制。4.CatS基因敲除小鼠來(lái)源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的與血管再生相關(guān)分子的蛋白以及磷酸化水平明顯低于野生型小鼠來(lái)源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞。做western來(lái)檢測(cè)相關(guān)的蛋白，再次觀察到CatS基因敲除小鼠來(lái)源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的PPAR-γ

8、、IRS-2、p-Akt、p-Erk、p-P38MAPK、p-GSK、p-eNOS和 VEGF的蛋白水平明顯低于野生型小鼠來(lái)源的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞。5.接受野生型小鼠骨髓移植，可以改善 CatS基因敲除小鼠的血管再生功能。將野生型小鼠的骨髓，注入到 CatS基因敲除的小鼠脛骨中；CatS基因敲除小鼠的骨髓注入到 CatS基因敲除的小鼠脛骨中。結(jié)果顯示：野生型小鼠的骨髓與 CatS基因敲除的小鼠骨髓相比明顯改善了缺血下肢血流。制備下肢缺血模型

9、21天后，利用CD31免疫染色分析了毛細(xì)血管的形成，同樣可以看出野生型小鼠的骨髓明顯改善了毛細(xì)血管的形成。6.CatS抑制劑明顯抑制下肢血流的恢復(fù)及毛細(xì)血管的形成。用激光多普勒超聲血流儀檢測(cè)下肢血流的動(dòng)態(tài)變化。觀察到術(shù)后即刻、術(shù)后1天血流明顯下降,術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù)，CatS抑制劑小鼠缺血下肢血流恢復(fù)明顯慢于正常對(duì)照組。用CD31免疫染色重點(diǎn)分析了毛細(xì)血管的形成。觀察到CatS基因敲除小鼠與正常對(duì)照組比較在缺血骨骼肌毛細(xì)血管形成

10、明顯受阻,CatS抑制劑小鼠的毛細(xì)血管密度明顯低于正常對(duì)照組。7.CatS抑制劑明顯影響動(dòng)脈環(huán)的微管腔的形成。利用組織蛋白酶抑制劑做了對(duì)動(dòng)脈環(huán)的微管腔形成的影響?？梢钥闯鲞x擇性抑制劑和非選擇性抑制劑，都明顯影響了動(dòng)脈環(huán)的微管腔的形成。8.CatS抑制劑影響與血管再生有關(guān)分子的蛋白及磷酸化水平的表達(dá)。選擇性 CatS抑制劑組的PPAR-γ、IRS-2、p-Akt、p-Erk、p-P38MAPK、p-GSK、p-eNOS和 VEGF的蛋白以

11、及磷酸化表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯降低。
　　結(jié)論：CatS在缺血性血管再生中的作用可能是通過(guò)血管再生相關(guān)的信號(hào)蛋白對(duì) ECs/EPCs生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制起作用，并可能通過(guò) PPAR-γ和VEGF/Akt信號(hào)通路起作用。組織蛋白酶 S有望成為治療缺血性心血管疾病的新的分子靶點(diǎn)。
　　冠心病患者血清中組織蛋白酶K的變化
　　目的:組織蛋白酶 K（CatK）是一個(gè)強(qiáng)有力的膠原酶參與人類和動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化血管重建。本研究測(cè)

12、定 CatK水平，并對(duì) CatK水平與 CAD發(fā)病以及冠心病危險(xiǎn)因素之間的關(guān)系進(jìn)行分析。從而尋找新的、有臨床意義的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定相關(guān)的生物標(biāo)志物。
　　材料與方法:2011年1月至2012年12月期間住院的患者經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影后分為冠心病組256例和非冠心病組129例。我們用免疫酶聯(lián)吸附法測(cè)定了組織蛋白酶 K、自動(dòng)生化分析儀測(cè)定高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白(LDL-C)、糖化血紅蛋白（HbA1C）、肌酐（Cr）、高

13、敏 C反應(yīng)蛋白（hs-CRP)等生化指標(biāo)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，組間計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，冠心病與危險(xiǎn)因素的關(guān)系采用多因素逐步回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)。
　　結(jié)果:CAD患者蛋白酶K水平有明顯高于非冠心病組(130.8±25.5 ng/mL和86.9±25.5 ng/ mL,p<0.001),急性冠脈綜合征患者血清組織蛋白酶K水平明顯高于穩(wěn)定型心絞痛組(137.1±26.9 n

14、g/ mL和102.6±12.9 ng/mL,p<0.001)。線性回歸分析表明,組織蛋白酶K含量與高密度脂蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.29,p<0.01)和與hs-CRP水平呈正相關(guān)(r=0.32,p<0.01)。多因素逐步回歸分析表明,組織蛋白酶K水平是CAD的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)(優(yōu)勢(shì)比,1.76;95％置信區(qū)間,1.12至1.56;p<0.01)。
　　結(jié)論:本研究中發(fā)現(xiàn)在冠心病患者血清中組織蛋白酶 K明顯升高，組織蛋白酶 K與