可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1在老年小鼠缺血性血管再生中的作用及其機(jī)制及心力衰竭患者血清中組織蛋白酶K濃度的臨床意義.pdf

1、第一部分:可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體sFlt-1在老年小鼠下肢缺血性血管再生中的作用及其機(jī)制
　　隨著社會(huì)的發(fā)展，生活水平日益提高，老齡化程度不斷加深，老年性下肢缺血性疾病的發(fā)病率也逐年上升。研究表明老化可削弱哺乳動(dòng)物體內(nèi)血管再生能力，從而導(dǎo)致組織再生能力的下降。在各種不同的哺乳動(dòng)物中，與年齡相關(guān)的特征是血管生長(zhǎng)因子失活及血管再生能力下降，表現(xiàn)為為血管內(nèi)皮功能障礙和骨髓(Bone-Marrow，BM)及外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endot

2、helial progenitor cells，EPCs)的數(shù)量減少和內(nèi)在功能減退，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與增殖的失衡，細(xì)胞外微環(huán)境變化（生長(zhǎng)因子缺乏、炎癥因子和氧化應(yīng)激增高等）等。
　　血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)于1989年首次發(fā)現(xiàn)，是一種能特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，具有促血管生成等活性的因子。VEGF家族成員包括胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PIGF)、VEGF A-

3、F及其受體VEGFR1-3及Neuropilins，其中VEGF受體特異性地分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞等，VEGF通過(guò)與其受體的結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)血管新生和增強(qiáng)血管通透性的生理作用。
　　VEGFR-1不僅在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在造血干細(xì)胞、造骨細(xì)胞、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞以及單核-巨噬細(xì)胞中也有表達(dá)。VEGFR-1與VEGF A-B-和PIGF有高度親和力。人體和動(dòng)物的研究已被證實(shí)體內(nèi)生成的可溶性VEGFR-1(sFlt-1)由VEGFR-1的細(xì)胞外部

4、分構(gòu)成，發(fā)揮抑制VEGF的作用，VEGFR-1在血管新生期及缺氧時(shí)表達(dá)上調(diào)。另有研究表明妊娠婦女伴有先兆子癇患者的血清中sFlt-1的水平升高，而PIGF和VEGF的水平反而降低。
　　眾所周知，生物缺氧/缺血導(dǎo)致促血管生長(zhǎng)因子的增加，如VEGF表達(dá)增加及其受體激活（包括Flt1和Flk1），誘導(dǎo)各種血管細(xì)胞的活動(dòng)（包括誘導(dǎo)血管細(xì)胞增殖、遷移、侵襲）增加，從已有的血管中生成新的小管樣結(jié)構(gòu)，使血管管腔進(jìn)一步成熟。越來(lái)越多的研究表明，

5、在各種病理?xiàng)l件下血管VEGF及其VEGFR剪接可引起抗血管再生作用。
　　可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(Soluble VEGFR1，sFlt1)被稱為血管VEGF的拮抗劑，是一種缺乏細(xì)胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的VEGFR剪接變體。最近的實(shí)驗(yàn)和臨床研究得出了許多重要的結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)中sFlt1通過(guò)結(jié)合并占據(jù)VEGFR從干擾VEGF占據(jù)和隨之增長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在代謝紊亂和冠心病患者中血漿sFlt1水平的改變與其疾病的治療與血管再

6、生相關(guān)。最近的血管生物學(xué)研究表明，在人和動(dòng)物的下肢缺血性疾病中，Wnt5/SC35的激活抑制血管再生，此外在骨髓細(xì)胞中，非正規(guī)的Wnt-sFlt1信號(hào)通路對(duì)血管再生起負(fù)性調(diào)控作用。老年下肢缺血性血管再生能力的減退是復(fù)雜的慢性的病理生理過(guò)程，然而其分子機(jī)制尚未完全闡明。
　　目的：探討老年小鼠的血管再生能力下降的分子機(jī)制，為臨床治療老年下肢缺血性疾病的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：建立下肢缺血小鼠模型，利用超聲多普勒檢測(cè)小鼠

7、下肢血流，采用免疫組化觀察缺血組織中巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞的表達(dá)和毛細(xì)血管密度，采用免疫印跡法、PCR和ELISA方法檢測(cè)血液中sFlt1水平、觀察Wnt/SC35表達(dá)及VEGFR2/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平;采用雙重免疫熒光法觀察分泌VEGF和sFlt1的細(xì)胞;明膠酶譜法觀察MMP-2/-9活性;利用流式細(xì)胞術(shù)觀察衰老對(duì)骨髓源EPC水平;利用siRNA-Wnt5轉(zhuǎn)染法觀察Wnt5a蛋白的表達(dá);培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞后利用Diff-Quik染

8、色，用BZ-Ⅱ分析儀計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，使用Cell Titer96AO試劑盒測(cè)定細(xì)胞遷移、侵襲和增殖率;采用5β-半乳糖苷酶(β Gal)染色法觀察HUVECs衰老表型。
　　結(jié)果：
　　1.老化對(duì)缺血性血管再生的影響
　　與年輕小鼠相比，老年小鼠缺血/非缺血血流量比值的恢復(fù)持續(xù)受阻，非缺血和缺血骨骼肌均毛細(xì)血管密度減低。
　　2.老化對(duì)sFlt1表達(dá)及下游信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響
　　與年輕小鼠相比，老年小鼠缺血骨

9、骼肌中總sFlt1基因水平顯著增加，sFlt1陽(yáng)性染色信號(hào)(即剪接變體的sFlt1(77 kDa)和sFlt114(82 kDa))表達(dá)明顯增加，F(xiàn)lt-1主要表達(dá)于浸潤(rùn)到巨噬細(xì)胞，p-VEGFR2和p-Akt蛋白表達(dá)降低。
　　3.老化對(duì)Wnt5a/11和SC35表達(dá)的影響
　　與年輕小鼠相比，在老齡小鼠缺血性骨骼肌中Wnt5a、Wnt5a mRNA及SC35蛋白表達(dá)均增高，并且Wnt11基因水平也增高，而其他Wnt家族成

10、員（Wnt3和3a、Wnt5b，WNT7a和7b、Wnt8a，Wnt9b，Wnt10a和10b），表達(dá)無(wú)顯著差異。
　　4.老化促進(jìn)缺血骨骼肌炎癥反應(yīng)
　　與年輕小鼠相比，老年小鼠缺血肌肉中Galectin-3蛋白及和TLR2蛋白表達(dá)水平增加，白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，MMP-2和MMP-9的Gelatinolytic活性水平顯著增高。
　　5.老化損害祖細(xì)胞的內(nèi)在功能
　　與年輕的老鼠相比，老年小鼠外周血c-K

11、it+/CD31+祖細(xì)胞數(shù)量顯著減少。老化明顯減弱VEGF-A誘導(dǎo)的c-Kit+的遷移、侵襲和增殖率。
　　6.老年小鼠骨髓源性CD11b+細(xì)胞分泌sFlt1
　　未加熱老化的骨髓源性CD11b+細(xì)胞(ACD11b+Cs)培養(yǎng)上清液(ACD11b+CM)抑制HUVEC的增殖，而未加熱年輕的CD11b+細(xì)胞(YCD11b+Cs)培養(yǎng)上清液(YCD11b+CM)刺激HUVEC的增殖;YCD11b+CM增強(qiáng)VEGF-A誘導(dǎo)的細(xì)胞增

12、殖，而在ACD11b+CM中無(wú)增殖效果;與YCD11b+Cs相比，缺氧刺激骨髓ACD11b+Cs的sFlt1蛋白合成分泌，而缺氧對(duì)年輕骨髓c-Kit+細(xì)胞(Yc-Kit+Cs)和老年骨髓c-Kit+細(xì)胞(Ac-Kit+Cs)的sFlt1蛋白合成無(wú)影響;YCD11b+CM刺激VEGF誘導(dǎo)的HUVEC形成小管腔結(jié)構(gòu)，而ACD11b+CM則抑制形成小管腔結(jié)構(gòu)。
　　7.Wnt5a/SC35調(diào)控sFlt1釋放及其下游VEGFR2/Akt信

13、號(hào)通路
　　Wnt5a不僅抑制其本身mRNA合成，而且抑制其下游SC35蛋白表達(dá)及缺氧誘導(dǎo)的sFlt1釋放;與siCont-濃縮ACD11b+CM相比，siWnt5a-濃縮ACD11b+CM明顯促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)HUVECs的VEGFR2和Akt磷酸化;siWnt5 a-ACD11b+CM明顯改善VEGF誘導(dǎo)的HUVEC形成小管樣結(jié)構(gòu);與不加熱ACD11b+CM相比，加熱siWnt5a ACD11b+CM抑制VEGF誘導(dǎo)的年輕EPC

14、-樣c-Kit+細(xì)胞增殖，具有EPC小管樣結(jié)構(gòu)的刺激作用。
　　結(jié)論：
　　1.老化可引起抑制血管再生能力。
　　2.sFlt1的表達(dá)水平增高可能是引起VEGFR2/Akt通路失活的原因，在降低老年動(dòng)物缺血誘導(dǎo)的血管再生中發(fā)揮決定性作用。
　　3.Wnt5a/SC35表達(dá)水平與老化有密切相關(guān)，表明老化可誘發(fā)缺血性缺血時(shí)過(guò)度的炎癥反應(yīng)。
　　4.骨髓CD11b+巨噬細(xì)胞可能是在缺血缺氧的應(yīng)激條件下sFlt1表

15、達(dá)的主要細(xì)胞來(lái)源，抑制老年小鼠的抗血管生成能力。
　　5.Wnt5a/SC35調(diào)控老化缺血骨骼肌中巨噬細(xì)胞合成及分泌sFlt1，通過(guò)減弱VEGFR2/Akt信號(hào)通路，抑制老年小鼠的血管再生能力。
　　老化抑制缺血性血管再生的機(jī)制可能是在缺血缺氧應(yīng)激條件下激活巨噬細(xì)胞Wnt5a/SC35軸依賴的sFlt1合成及分泌，從而降低ECs和EPCs中VEGFR2/Akt信號(hào)通路的失活而導(dǎo)致老化缺血性血管再生能力減退。
　　第二部

16、分:心力衰竭患者血清中組織蛋白酶K濃度的臨床意義
　　半胱氨酰組織蛋白酶(Cysteinyl cathepsins)是半胱氨酸的木瓜蛋白酶家族成員之一，是蛋白酶超級(jí)家族。在人類(lèi)中，已經(jīng)識(shí)別確定了11種該家族成員，即cathepsinsB，C，F(xiàn)，H，K，L，O，V，W，和X。所有成員共享一個(gè)守恒:即與半胱氨酸、組氨酸和門(mén)冬氨酸殘留物形成活躍的三維立體的囊狀結(jié)構(gòu)。組織蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)包括信號(hào)肽，前導(dǎo)肽，重鏈及輕鏈。正常情況下，組織蛋

17、白酶在核糖體以帶有N端信號(hào)肽的前體形式存在，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，定位到高爾基體，甘露糖殘基被修飾為6-磷酸甘露糖（mannose-6 reside phosphorylation，M6P）。修飾后，通過(guò)6-磷酸甘露糖受體依賴性或非依賴性通路轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體，逐步被多種蛋白水解酶（如胃蛋白酶、嗜中性彈性蛋白酶、組織蛋白酶D）激活或自身激活，并以鈣離子依賴的“胞吐”(exocytosis)方式分泌到細(xì)胞外，參與溶酶體蛋白質(zhì)的重新利用。近年

18、來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的血管生成和心血管疾病中扮演著非傳統(tǒng)的角色。不僅如此，最近專(zhuān)家們研究還發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶在溶酶體以外的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外參與信號(hào)傳遞和調(diào)控細(xì)胞功能，并在血管生成及心血管重構(gòu)過(guò)程中扮演著非傳統(tǒng)的角色。
　　組織蛋白酶K(Cathepsin K，CatK)是木瓜蛋白酶家族的一員，初期發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞分泌，隨后發(fā)現(xiàn)在血管動(dòng)脈硬化病變部位血管平滑肌細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的高表達(dá)等。除能降解膠原蛋白外，還能

19、降解彈力蛋白及纖維蛋白，并在骨質(zhì)重塑以及血管再生和動(dòng)脈硬化形成及發(fā)展中起極其重要作用。已有研究證明在衰竭的心臟中，組織蛋白酶的表達(dá)發(fā)生變化，提示組織蛋白酶參與這一病理變化。Hua等研究中發(fā)現(xiàn)高脂飲食相關(guān)受損心肌細(xì)胞收縮功能和細(xì)胞內(nèi)Ca2+處理，是通過(guò)組織蛋白酶K基因敲除來(lái)調(diào)節(jié)。此外，組織蛋白酶K抑制，可以使棕櫚酸誘導(dǎo)的受損的心肌收縮力恢復(fù)，這表明組織蛋白酶K直接調(diào)節(jié)心肌收縮力。研究者們一直認(rèn)為上調(diào)肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)的表達(dá)，可以

20、降低心臟肥大。而Hua等發(fā)現(xiàn)了高脂喂養(yǎng)之后SERCA2a和phospholamban（受磷蛋白）表達(dá)上調(diào)，更重要的是組織蛋白酶K敲除之后導(dǎo)致受磷蛋白與SERCA2a表達(dá)比例提高，盡管這些變化的機(jī)制目前尚不明確。在組織蛋白酶K敲除的小鼠心肌細(xì)胞中靜息Ca2+濃度增加和SERCA2a的表達(dá)上調(diào)，可以部分地解釋組織蛋白酶K敲除所致心肌收縮力提高的機(jī)制。2013年，作者們?cè)谘芯恐杏袀€(gè)突出的發(fā)現(xiàn)，老鼠缺乏組織蛋白酶K基因有抵抗壓力負(fù)荷誘發(fā)的心臟肥

21、厚、纖維化及收縮異常的現(xiàn)象，在分子水平上組織蛋白酶K敲除減緩壓力負(fù)荷誘發(fā)的心臟肥厚。在心肌細(xì)胞，壓力超負(fù)荷抑制了心肌細(xì)胞收縮功能，隨同降低了靜息的Ca2+水平和延遲了Ca2+的清除，中斷了細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)態(tài)平衡，其中調(diào)解效果是通過(guò)組織蛋白酶K的敲除來(lái)完成。組織蛋白酶K敲除未能改變壓力超負(fù)荷之后的小鼠的血壓，提示組織蛋白酶K敲除后的收益為心臟特異性。研究中還發(fā)現(xiàn)上調(diào)組織蛋白酶K表達(dá)的小鼠左心室組織受到壓力負(fù)荷之后，更快的出現(xiàn)心臟衰竭。由此可

22、見(jiàn)，組織蛋白酶K在心臟肥厚中起著致病、促進(jìn)心臟肥厚等作用。
　　最近，本課題組在臨床研究中發(fā)現(xiàn)了在心房纖顫和冠心病患者血漿中Cat K增高，但尚無(wú)慢性心衰與血漿中的Cat K的濃度相關(guān)性的研究。
　　目的：
　　探討慢性心衰患者血漿中Cat K濃度變化及其臨床意義，試圖找出CHF患者血液各項(xiàng)指標(biāo)中有用的非侵入性生物標(biāo)志物。
　　方法：
　　選擇為2012年3月至2014年3月就診于延邊大學(xué)附屬醫(yī)院的慢性心衰

23、(CHF)失代償患者共計(jì)134例，所有入選患者的標(biāo)準(zhǔn)均為心功能NYHA分級(jí)Ⅱ-Ⅳ級(jí)并伴有射血分?jǐn)?shù)降低的CHF患者（包括有心肌梗死病史，原發(fā)性高血壓或特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的CHF患者）。CHF患者接受標(biāo)準(zhǔn)藥物治療包括:利尿劑，正性肌力藥物（如地高辛），他汀類(lèi)藥物，β-受體阻滯劑，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅰ型受體拮抗劑（ARB），將全部患者以左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)值不同分為低EF值組(EF＜40％，n=44)和高EF值

24、組(EF≥40％，n=90)。
　　全部患者取靜脈血液使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿CatK濃度、N末端腦鈉肽(NT-proBNP)、肌鈣蛋白、LDL、HDL、hs-CRP和HbAic水平
　　采用SONOS2500的超聲心動(dòng)圖診斷儀測(cè)定左室后壁厚度(LVPWT)、室間隔厚度(IVST)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)，左心室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，使用M-型法測(cè)量左房?jī)?nèi)徑（LAD）

25、。
　　結(jié)果：
　　1.兩組患者的年齡和體重指數(shù)無(wú)顯著性差異。
　　2.線性回歸結(jié)果分析表明血漿CatK水平與LVEF(r=-0.4，P＜0.001)呈負(fù)相關(guān)，與LVDd(r=0.2，P＜0.01)和LVDs(r=0.3，P＜0.001)水平呈正相關(guān)，血漿CatK水平和LAD(r=0.3，P＜0.01)也呈正相關(guān)。
　　3.134例患者中心功能Ⅱ級(jí)的患者17例、心功能Ⅲ級(jí)的患者47例、心功能Ⅳ級(jí)的患者70例。LV

26、Dd和LVDS的測(cè)定值分別為55.9±14.5mm和48.7±11.9mm，提示左心室擴(kuò)張。IVST和LVPWT的測(cè)定值分別為9.3±1.5 mm和12.5±2.1 mm。LVEF降低至41.9±8.3％。血漿BNP及CatK濃度分別為4024±4026 pg/ml和51.6±16.6 ng/ml。在低LVEF值組患者中腦血管疾病，或接受血管修復(fù)術(shù)的發(fā)病率更高，表明低LVEF值組患者更需要接受醛固酮受體拮抗劑、利尿劑和地高辛這些傳統(tǒng)藥物

27、的綜合治療;兩組IVST或LVPWT值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.在單因素回歸分析中年齡、性別、高血壓、LVDd、LAD、和CatK水平與CHF顯著相關(guān)。而體重指數(shù)，糖尿病，超敏C反應(yīng)蛋白和肌鈣蛋白Ⅰ與CHF是無(wú)相關(guān)性。多元回歸分析結(jié)果表明高血壓(比值比[OR]4.11;95％可信區(qū)間[CI]1.08-15.69; P＜0.05)、LAD(比值比[OR]1.13;95％ CI1.01-1.25; P＜0.05)、左心室舒張末期內(nèi)徑