可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞的抗肺癌轉(zhuǎn)移作用.pdf

1、一、研究背景 到目前為止，肺癌已成為當(dāng)今世界男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌約占80％，診斷確立時(shí)僅30％的患者有手術(shù)機(jī)會(huì)，無手術(shù)機(jī)會(huì)的患者預(yù)后極差，及時(shí)采用放、化療等綜合治療，大都數(shù)患者在5年之內(nèi)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。盡管第三代化療藥物不斷涌現(xiàn)，但5年生存率提高極為有限，東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)將標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇/順鉑方案與其他三種含鉑類方案的療效進(jìn)行對(duì)比，中位生存期、1、2年存活率的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，對(duì)于非小細(xì)胞肺癌

2、的治療，迫切需要新的方案。生物靶向治療的出現(xiàn)，給肺癌的治療帶來了新的希望。目前臨床常用的肺癌靶向治療有兩個(gè)重要靶點(diǎn)，一個(gè)是表皮生長(zhǎng)因子及受體(EGFR)，另一個(gè)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及受體(’VEGFR)，前者主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，后者主要介導(dǎo)腫瘤新生血管的形成。有研究證實(shí)，腫瘤超過1～2mm3時(shí)，其生長(zhǎng)必須依賴腫瘤新生血管的形成，抑制腫瘤新生血管的形成能顯著抑制腫瘤的增生和轉(zhuǎn)移。目前發(fā)現(xiàn)與腫瘤新生血管有關(guān)的細(xì)胞因子有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因

3、子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是形成新生血管最關(guān)鍵的因子，目前有多種方法如反義核酸技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、小分子RNA干擾技術(shù)、可溶性受體技術(shù)等來阻斷VEGF與受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤新生血管的形成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，以DC為基礎(chǔ)的抗腫瘤主動(dòng)免疫成為研究熱點(diǎn)，有學(xué)者利用DC強(qiáng)大的抗原提呈功能，用于抗腫瘤新生血管形

4、成，結(jié)果令人滿意。Schmitt用膀胱癌患者腫瘤細(xì)胞提取mRNA轉(zhuǎn)染自體DC，與T細(xì)胞共培育，CTL應(yīng)答反應(yīng)明顯上升，抑制腫瘤誘導(dǎo)的新生血管形成，具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。本文研究了VEGFR-2胞外區(qū)，即可溶性VEGFR-2(sVEGFR)cDNA修飾DC抗肺癌轉(zhuǎn)移作用及其機(jī)制。 二、材料與方法 (一)實(shí)驗(yàn)材料 1.小鼠、質(zhì)粒、細(xì)胞 2.分子克隆及細(xì)胞培養(yǎng)試劑。 (二)實(shí)驗(yàn)方法 用Tri

5、zol一步法從表達(dá)VEGFR-2的小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞系H5V(H-2b)提取總RNA。用First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司產(chǎn)品)將1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增sVEGFR-2基因片段，上游引物(P1)：5’-CG GGATCC ATG GAGAGC AAG GCG CTG-3’；下游引物(P2)：5’-G GAATrC TCATTCCAA GTT GGT CTT TTV-3

6、’；目的片段為2304 bp。PCR產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳鑒定并將片段切下膠回收，T-A克隆構(gòu)建pMD18-T/sVEGFR-2，T-A克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，小量抽提pMD18-T/sVEGFR-2重組質(zhì)粒，對(duì)抽提的質(zhì)粒進(jìn)行BamHI-EcoRI雙酶切鑒定，對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序正確的pMD18-T/sVEGFR-2質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)空載體質(zhì)粒分別以BamHI和EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物分別作瓊脂

7、糖凝膠電泳，將sVEGFR-2目的片段與pcDNA3.1(+)載體大片段分別切下膠回收。將膠回收sVEGFR-2目的片段與膠回收表達(dá)載體pcDNA3.1(+)作連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)16-20h后挑選單個(gè)菌落若干擴(kuò)增，小量抽提pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2重組質(zhì)粒，BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒為構(gòu)建成功的pcDNA3.1(+)/sVEGFR．2質(zhì)粒；取C57BL/6小鼠骨

8、髓，處理后將骨髓細(xì)胞配成2x106/ml，于6孔板上，每孔加3ml，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，完成DC的制備；將構(gòu)建成功的pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2質(zhì)粒用電穿孔法基因轉(zhuǎn)染DC：酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定sVEGFR-2的表達(dá)；將轉(zhuǎn)染后DC免疫小鼠：將C57BL/6小鼠分為4組，經(jīng)尾靜脈分別給小鼠注射PBS、DC、pcDNA3.1修飾的DC(DC．vector)和pcDNA3.1/sVEGFR-2修飾的DC(DC

9、-sVEGFR-2)，每只小鼠注射劑量為100μl，連續(xù)3次，每次間隔1周；第3次免疫注射后10天，給小鼠后腿足墊內(nèi)注射3LL Lewis肺癌細(xì)胞(2×105細(xì)胞/鼠，每組8～10只小鼠)，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到6mm時(shí)，截去荷瘤小腿。當(dāng)對(duì)照組荷瘤小鼠開始死亡時(shí)，處死各組小鼠，計(jì)數(shù)肺表面腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。 三、結(jié)果 (1)PCR產(chǎn)物為2304bp，包括含信號(hào)肽序列的三sVEGFR-2cDNA(208～2493bp)，BamH I(

10、5’)和EcoR I(3’)兩個(gè)酶切位點(diǎn)以及人為加上的終止密碼。 (2)sVEGFR-2 cDNA測(cè)序結(jié)果(5’端)，與標(biāo)準(zhǔn)序列一致。 (3)5個(gè)不同克隆的pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2 BamHI和EcoRI雙酶切結(jié)果均得到目的片段和載體片段，表明目的片段已成功插入到BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，所構(gòu)建的質(zhì)粒正確。 (4)用電穿孔法將pcDNA3.1/GFP轉(zhuǎn)染DC，轉(zhuǎn)染效率為71％。經(jīng)sVEG

11、FR-2轉(zhuǎn)染的DC可有效表達(dá)sVEGFR-2，而DC-vector和DC不表達(dá)sVEGFR-2，統(tǒng)計(jì)學(xué)有非常顯著差異(P<0.01.)。 (5)經(jīng)DC-sVEGFR-2免疫的小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯減少，與對(duì)照組相比，差異有非常顯著的意義。 四、討論 新生血管的生成是肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，如果沒有腫瘤新生血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，腫瘤長(zhǎng)到1～2mm3就會(huì)停止生長(zhǎng)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及受體是重要的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，與肺癌增

12、殖和轉(zhuǎn)移有著十分密切的關(guān)系。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體是目前肺癌靶向治療的重要靶點(diǎn)。樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)專職的抗原提呈細(xì)胞，具有獨(dú)特的刺激T細(xì)胞增殖的能力，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)因素，是一種天然的免疫佐劑。應(yīng)用sVEGFR-2基因轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞疫苗，能高水平地表達(dá)sVEGFR-2，中和VEGF，打斷VEGF/VEGFR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制腫瘤新生血管形成；此外，還去除了VEGF對(duì)樹突狀細(xì)胞的抑制，提高樹突狀細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水

13、平。經(jīng)sVEGFR-2基因轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞疫苗，還可以誘導(dǎo)機(jī)體針對(duì)VEGFR的特異性免疫應(yīng)答，直接殺傷新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞，強(qiáng)烈抑制新生血管的生成，從而腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。從本研究結(jié)果分析，由于3LL Lewi s肺癌細(xì)胞本身不表達(dá)VEGFR-2，經(jīng)DC-sVEGFR-2免疫的小鼠抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并不是對(duì)肺癌細(xì)胞的直接殺傷，進(jìn)一步說明新生血管形成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞具有遺傳穩(wěn)定性，以此為靶點(diǎn)可以減少耐藥性的產(chǎn)生，具有一定