可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1（sFlt-1）對結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景及目的]： 結(jié)腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，居我國因腫瘤而致死亡原因的第四位，而且發(fā)病率有逐年上升的趨勢。盡管當(dāng)前的常規(guī)治療手段，包括手術(shù)及放療、化療能在一定程度上緩解患者的痛苦，延長其壽命，但總的治療效果還是不能讓人滿意。因此，迫切需要發(fā)展或聯(lián)合新的治療方法或新的治療策略。 以往的研究結(jié)果表明，腫瘤新生血管的形成不僅與結(jié)腸癌細(xì)胞的生長、增殖關(guān)系密切，而且與癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移也緊密相關(guān)，并可作為結(jié)腸癌治療的

2、一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。因此，針對腫瘤新生血管的形成己成為目前結(jié)腸癌治療中的一個(gè)新靶點(diǎn)。 腫瘤新生血管的形成受多種因素的影響，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的最強(qiáng)的血管生成促進(jìn)因子，它通過與其相應(yīng)受體Flt-1(fms-like tyrosine kinase-1，F(xiàn)lt-1)及Flk-1／KDR(fetal liver kinase-1，F(xiàn)lk-1／

3、kinase insert domain-containing receptor,KDR)相結(jié)合是發(fā)揮其促血管生成的功能，其中Fit-1與VEGF的親和力比Flk-1高7-10倍。據(jù)報(bào)道，VEGF在正常腸上皮細(xì)胞中不表達(dá)或極低表達(dá)，與之相反，對結(jié)腸癌腫瘤標(biāo)本的研究顯示，VEGF在癌組織中高表達(dá)，結(jié)腸癌細(xì)胞可分泌大量的VEGF；進(jìn)一步的研究顯示，VEGF在癌組織中的表達(dá)水平與患者TMN分期以及預(yù)后密切相關(guān)。這些研究為下一步針對VEGF及其

4、受體為靶點(diǎn)的治療打下了良好的理論基礎(chǔ)。 可溶性Flt-1(soluble Flt-1，sFlt-1)是一種體內(nèi)天然存在的、低表達(dá)豐度的VEGF拮抗劑，是內(nèi)源性表達(dá)的Flt-1的剪切形式。sFlt-1缺少Flt-1的跨膜部分和胞內(nèi)部分，與VEGF結(jié)合后，不具備酪氨酸激酶的活性，可以抑制VEGF的促血管生成的生物學(xué)功能。已有研究證實(shí)，sFlt-1的第1-3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)區(qū)域?yàn)榕cVEGF結(jié)合所必需，且等同于全長sFlt-1與VEGF的結(jié)

5、合能力。應(yīng)用sFlt-1對抗血管生成，是治療腫瘤是理想的選擇。 基于以上所述，VEGF及其受體在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。針對VEGF及sFlt-1為靶點(diǎn)治療結(jié)腸癌有著光明的前景。本研究針對sFlt-1這種天然存在的強(qiáng)大的VEGF拮抗劑，體外克隆構(gòu)建sFlt-1的第1-3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)區(qū)域，將其與真核載體pcDNA3.0連接后，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，探討其對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞生長增殖的影響。 [研究方法]：

6、 1.應(yīng)用RT-PCR的方法從人臍血靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中擴(kuò)增sFlt-1基因的第1-3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)區(qū)域，并將其克隆至TA載體中。對TA克隆中的sFlt-1基因進(jìn)行酶切及PCR鑒定，并測序。陽性克隆命名為T-sFlt。 2.應(yīng)用PCR的方法從T-sFlt質(zhì)粒擴(kuò)增sFlt-1基因，并將其與真核載體pcDNA3.0連接，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcDNA-sFlt。應(yīng)用酶切鑒定、PCR、DNA測序的方法，對重組體進(jìn)行鑒定。 3.通過脂質(zhì)

7、體Lipofectamine 2000介導(dǎo)重組體pcDNA-sFlt轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞。對轉(zhuǎn)染后篩選出的陽性細(xì)胞克隆，應(yīng)用RT-PCT的方法檢測sFlt-1 mRNA的表達(dá)，應(yīng)該ELISA的方法檢測sFlt-1蛋白的表達(dá)。 4.應(yīng)用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清對LoVo細(xì)胞生長情況的影響，同時(shí)用ELISA法檢測不同轉(zhuǎn)染時(shí)間段LoVo細(xì)胞上清中VEGF濃度的變化。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]： 1.以RT-PCR的方法從人臍

8、血靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中成功擴(kuò)增出大小約1000bp的DNA片段；其與TA克隆載體連接后，經(jīng)酶切及PCR鑒定，電泳結(jié)果表明有目的基因片段的插入；對T-sFlt重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果同GenBank上的Flt-1的基因序列進(jìn)行比對，完全吻合，未發(fā)現(xiàn)任何堿基突變。 2.以PCR的方法從T-sFlt重組質(zhì)粒中成功擴(kuò)增出大小約1000bp的DNA片段，與預(yù)計(jì)相符；PCR產(chǎn)物與真核載體pcDNA3.0連接后，經(jīng)酶切及PCR鑒定，顯示有目的

9、基因片段的插入；對pcDNA-sFlt重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果與GenBank上的Flt-1的基因序列進(jìn)行比對，完全吻合，未發(fā)現(xiàn)堿基突變。 3.pcDNA-sFlt重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞后RT-PCR檢測目的基因mRNA表達(dá)，電泳可見目的基因條帶，說明有轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。ELISA檢測到細(xì)胞培養(yǎng)上清中sFlt-1重組蛋白，說明轉(zhuǎn)染后的LoVo細(xì)胞能表達(dá)sFlt-1并將其分泌到上清中，分泌量48小時(shí)達(dá)到高峰。

10、 4.各轉(zhuǎn)染時(shí)段的細(xì)胞培養(yǎng)上清液均能抑制LoVo細(xì)胞的生長，說明重組蛋白具有生物學(xué)活性。其中轉(zhuǎn)染48小時(shí)的上清液作用最明顯，抑制作用與蛋白分泌量結(jié)果相符。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清VEGF濃度顯示，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液上清中的VEGF濃度均有所降低。 [結(jié)論]： 成功克隆sFlt-1基因的第1-3個(gè)Ig樣區(qū)域，構(gòu)建pcDNA-sFlt真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，并獲得具有生物學(xué)活性的重組sFlt-1蛋白，為下一步的動(dòng)