化合物6r對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　癌癥極大地危害著人類(lèi)的生命健康，化學(xué)藥物治療仍是目前腫瘤治療的主要手段。而腫瘤針對(duì)性較強(qiáng)的化學(xué)藥物治療將成為腫瘤治療的主攻方向。結(jié)腸癌是高發(fā)病率且高死亡率的惡性腫瘤之一，找到一種有效、作用特異的化學(xué)治療藥物是非常必要的。PTEN是一新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但其確切的作用機(jī)制以及作用信號(hào)通路仍在研究之中。研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在結(jié)腸癌的形成及致癌過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。
　　化合物5-[2，3-

2、二氯-4-(2-亞甲基-1-代丁基)氯苯]-3-甲基-1，2，4-噁二唑(6r)是含有噁二唑基團(tuán)的依他尼酸(EA)的衍生物。前期研究表明，6r能在體外、體內(nèi)抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，例如6r能有效的抑制人前列腺癌、骨髓性白血病、人宮頸癌、結(jié)腸癌等，提示其具有較好的抗腫瘤活性。本課題選4種不同的人結(jié)腸癌細(xì)胞株，深入探討化合物6r抑制人結(jié)腸癌增殖的作用機(jī)制及其抗增殖作用與人結(jié)腸癌細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　實(shí)驗(yàn)方法

3、r>　　首先，采用MTT法檢測(cè)6r對(duì)4種人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、SW620、HCT116和Lovo生長(zhǎng)的抑制作用。Westernblotting法檢測(cè)4種細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)水平及6r對(duì)PTEN表達(dá)水平的影響。
　　其次，考察化合物6r對(duì)PTEN介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響。采用FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)6r對(duì)HT29和HCT116細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用;碘化丙啶(PI)單染法檢測(cè)6r對(duì)HT29和HCT116細(xì)胞周期的影響。劃痕

4、試檢測(cè)6r對(duì)HT29細(xì)胞遷移能力的影響。Westernblotting法檢測(cè)6r對(duì)HT29、SW620和HCT116細(xì)胞中PI3K、P-AKT、MDM2及P53蛋白表達(dá)水平的影響。
　　最后，觀察PTEN抑制劑VO-OHpic是否能抑制6r對(duì)PTEN介導(dǎo)的下游信號(hào)通路的影響及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。采用MTT法檢測(cè)VO-OHpic存在時(shí)6r對(duì)HT29和HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)在VO-OHpic作用下6r

5、對(duì)HT29和HCT116細(xì)胞的毒性作用。Westernblotting法檢測(cè)在VO-OHpic作用下6r對(duì)HT29和HCT116細(xì)胞內(nèi)P-AKT和P53蛋白表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1化合物6r對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抗癌效應(yīng)與PTEN有關(guān)
　　MTT結(jié)果顯示，6r對(duì)3種結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、HT29和SW620的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)Lovo細(xì)胞抑制作用較弱。Westernblotting結(jié)果顯示在無(wú)6r存在時(shí)，H

6、CT116、HT29、SW620和Lovo細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平依次降低;而在化合物6r作用下，HCT116、HT29、SW620和Lovo四種細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平明顯增加，且具有劑量依賴性。
　　26r通過(guò)激活PTEN介導(dǎo)的下游通路抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)
　　FITC-AnnexinⅤ/PI雙染法試驗(yàn)結(jié)果顯示，2、4、6μM三個(gè)濃度的6r處理HT29和HCT116細(xì)胞48h，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。PI單染法試驗(yàn)結(jié)果顯示，

7、2、4、6μM6r處理HT29和HCT116細(xì)胞48h，處于S期的細(xì)胞數(shù)比例顯著增加，證明6r可阻滯HT29和HCT116細(xì)胞周期于S期。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，4、6μM6r分別處理HT29細(xì)胞12、24、36、48h，在36、48h時(shí)能顯著抑制細(xì)胞遷移率。Westernblotting結(jié)果顯示，6r可顯著下調(diào)HT29和HCT116細(xì)胞中pro-casepase-3和pro-casepase-9蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax/Bcl-2的比例;顯著

8、下調(diào)HCT116、HT29和SW620中PI3K、P-AKT和MDM2蛋白的表達(dá)，上調(diào)P53蛋白的表達(dá)。
　　3VO-OHpic抑制PTEN介導(dǎo)的信號(hào)通路，降低6r抗腫瘤作用
　　MTT及臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)均顯示，在抑制劑VO-OHpic(500nM)存在時(shí)，6r(6μM)對(duì)HT29和HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用明顯減弱，與單用6r(6μM)組相比有顯著性差異。Westernblotting結(jié)果顯示，單用6r組HT29和HCT