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文檔簡介
1、目的:構建攜帶可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1(sFlt-1)目的基因的重組真核表達載體,將sFlt-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC),觀察目的基因在內(nèi)皮細胞中的表達,并將sFlt-1重組質(zhì)粒導入動脈粥樣硬化斑塊內(nèi),觀察局部高表達的sFlt-1對動脈粥樣硬化斑塊的作用。 方法:1.攜帶sFlt-1cDNA的重組基因載體的構建:從含有目的基因的質(zhì)??寺∧0逯?,利用酶切的方法獲得目的基因,酶切目的載體,純化酶切產(chǎn)物后
2、進行定向連接,轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞,對長出的克隆進行PCR鑒定,陽性克隆證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對,比對正確的即為構建成功的融合蛋白表達質(zhì)粒載體。2.HUVEC的培養(yǎng)以及western blotting檢測sFlt-1基因在HUVEC中的表達:pEGFP-N1-sFlt-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HUVEC,通過熒光及western blotting檢測sFlt-1基因在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞的
3、表達。3.sFlt-1基因?qū)用}粥樣硬化斑塊的影響:雄性新西蘭大白兔48只,隨機分為4組。①正常對照組(n=8)。②假手術組(n=8)。③球囊損傷+高脂飲食+pEGFP-N1組(n=16)。④球囊損傷+高脂飲食+pEGFP-N1-sFlt-1組(n=16)。一、二兩組給予正常顆粒飼料飲食,三、四兩組給予高脂飲食,兩周后第二組行假手術,三、四兩組均行髂動脈球囊損傷血管內(nèi)皮,其中第三組在球囊損傷后導入空質(zhì)粒pEGFP-N1,第四組球囊損傷后
4、導入目的基因sFlt-1,3天后western blotting檢測局部sFlt-1基因的表達。實驗開始及實驗結束時分別檢測高脂血癥的形成情況。3個月后取靶血管行HE染色對斑塊進行形態(tài)學測量,CD34免疫組化陽性細胞數(shù)檢測觀察新生血管形成情況。 結果:1.成功構建攜帶sFlt-1基因的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-sFlt-1,2.sFlt-1基因轉(zhuǎn)染HUVEC后有效表達,3.成功制備兔髂動脈粥樣硬化斑塊模型,4.sFlt-1基因有
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