腺病毒載體介導的可溶性VEGF受體Flt-1（sFlt-1）抑制多發(fā)性硬化單核-巨噬細胞浸潤的實驗研究.pdf

1、Y 14 0 6 8 5 6中山大學博士學位論文腺病毒載體介導的可溶性V E G F 受體F l t - 1 ( s F l t - 1 )抑制多發(fā)性硬化單核／巨噬細胞浸潤的實驗研究A d e n o v i r u sM e d i a t e d S o l u b l e V E G F R e c e p t o r F l t - I ( s F I t —1 1G e n e D e l i v e r y I n h i

2、b i t sM o n o c y t e L i n e a g e C e l l s R e c r u i t m e n ti ne x p e r i m e n t a la u t o i m m u n e e n c e p h a l o m y e l i t i s博士研究生：朱燦勝學科、專業(yè)：神經病學導 師：胡學強教授答辯委員會主席答辯委員會委員中山大學附屬第三醫(yī)院廣州二o o 七年六月二日中山大學博士學位

3、論文競爭結合V E G F ，并且能與膜表面受體F i t ．1 及K D R 形成同源或異源二聚體，中止活化信號的傳遞，從而阻斷V E G F 的生物學活性，因此s F l t ．1 可能是V E G F 體內天然抑制劑。目前國外已有利用s F l t ．1 進行抑瘤研究的報道，且收效較為顯著。V E G F 對單核細胞具有趨化作用，誘導其遷移。單核／巨噬細胞表達F i t ．1 ，在受到巨噬細胞抗原刺激后表達上調。V E G F 的

4、趨化作用認為是通過這一受體實現的。因此，利用V E G F 體內天然抑制劑s F l t ．1 可以在體內封閉M SC N S 內升高的V E G F ，抑制其對炎癥細胞尤其是巨噬細胞的趨化作用，從而達到治療的目的。研究方法：1 ) 通過P C R 方法擴增s F l t ．1 ( 1 —3 ) 基因，然后應用腺病毒包裝系統(tǒng)構建攜帶人s F l t ．1 ／F L A G 融合基因的重組腺病毒載體( A d ．s F l t ．1 ／F

5、 L A G ) 。應用E L I S A 、免疫組織化學、免疫熒光化學和W e s t e r n ．b l o t 法檢測所構建的重組腺病毒載體在真核細胞中的表達。通過T r a n s w e l l 巨噬細胞趨化實驗和M a t r i g e lp l u g 分析，進一步證實重組腺病毒所表達目的的生物學功能；2 ) 選取D A 大鼠作為實驗動物，應用豚鼠脊髓加完全福氏佐劑制成勻漿誘導E A E 模型；3 ) 應用F E R

6、I D E X M R I 檢查監(jiān)測E A E C N S 內單核／巨噬細胞的浸潤情況；4 ) 通過側腦室注射A d ．s F l t ．1 ／F L A G 阻止E A E C N S 內單核／巨噬細胞浸潤，并通過發(fā)病情況、病理改變、免疫組織化學、免疫熒光化學觀察，評價治療效果結果：成功構建了A d ．s F l t 一1 ／F L A G ，P C R 檢測證實無野生型腺病毒及腺相關病毒的污染，E L I S A 、免疫組織化學、免

7、疫熒光化學和W e s t e r n ．b l o t 法檢測顯示所構建的腺病毒載體攜帶的基因能夠在真核細胞中得到表達。T r a n s w e l l 巨噬細胞趨化實驗和M m r i g e l p l u g 分析顯示V E G F 對巨噬細胞具有趨化作用，而s F l t ．1 蛋白具有抑制V E G F對巨噬細胞趨化作用。選擇D A 大鼠可成功誘導E A E 模型，通過常規(guī)M R I 檢查可發(fā)現E A E 動物模型腦部病灶

8、，F E R I D E X 增強M Ⅺ檢查可以監(jiān)測E A EC N S 巨噬細胞浸潤情況。A d ．s F l t ．1 ／F L A G 側腦室注射組動物發(fā)病率為5 0 ％，臨床評分為2 ．0 士1 ．o o ，與側腦室注射P B S ( 發(fā)病率1 0 0 ％，臨床評分3 ．4 士1 ．0 7 ) 和A d ．e G F P ( 發(fā)病率8 7 ．5 ％，臨床評分3 ．3 士0 ．9 7 ) 組相比，差異具有顯著性。免疫組化及免疫熒光

9、染色發(fā)現E A EC N S 組織，尤其是脊髓，有大量的V E G F 表達細胞，主要為星形膠質細胞，同時有伴有巨噬細胞浸潤。A d ．s F l t ．1 ／F L A G 側腦室注射可以抑制E A EC N S 內單核／巨噬細胞的浸潤，從而降低E A E 的發(fā)病率和改善E A E 病情。結論：本研究成功構建了人s F l t ．1 基因重組腺病毒( A d —s F l t ．1 ／F L A G ) ，并融合F L A G 標簽；