可溶性CD40-IgG1 Fc融合基因重組腺病毒載體的構(gòu)建與抑制粥樣硬化斑塊重構(gòu)的體外研究.pdf

1、該研究通過對承載可溶性CD40/IgG Fc融合基因的質(zhì)粒pCD40插入片斷進(jìn)行測序，構(gòu)建并合成引物，采用PCR方法獲得目的基因，從而應(yīng)用亞克隆的方法逐步構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒與重組腺病毒基因組質(zhì)粒，經(jīng)線性化后以脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，凍融后獲得原代病毒，經(jīng)過293細(xì)胞的擴增，以終點稀釋試驗的方法檢測病毒滴度.得到重組腺病毒滴度達(dá)到1.3X10<'8>PFU.通過ELISA與Western blotting方法檢測目的蛋白可溶性CD40表達(dá)

2、，通過PCR方法驗證目的基因.該研究以脂質(zhì)體方法將可溶性CD40/IgG1 Fc重組pcDNA3.1轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304，通過200μg/ml G-418抗性篩選轉(zhuǎn)染克隆，或以重組腺病毒按10-100pfu/細(xì)胞感染上述細(xì)胞，并采用ELISA與Western blotting方法檢測可溶性CD40表達(dá).研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒感染的內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304表達(dá)目的蛋白水平顯著高于以重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞株.該研究通過流式細(xì)胞術(shù)的方法

3、，驗證了內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304膜表面存在CD40高表達(dá)，從而為可溶性CD40的功能研究奠定了實驗基礎(chǔ).該實驗研究觀察了體外可溶性CD40表達(dá)載體阻斷CD40-CD40L結(jié)合的抗重構(gòu)效果.以正常血管內(nèi)皮細(xì)胞為空白對照，并同時設(shè)立抗CD40抗體陰性對照.首先將抗CD40抗體與正常內(nèi)皮細(xì)胞孵育10分鐘，再分別加入重組人CD40L，培養(yǎng)24小時，分別于0，2，6，12，24小時收集上清液，并通過ELISA方法定量檢測可溶性CD40與基質(zhì)金屬蛋