組織蛋白酶C在牙周炎癥反應(yīng)中的功能初探.pdf

1、掌跖角化-牙周破壞綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome，PLS）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，嚴(yán)重的早發(fā)性牙周炎是其主要的臨床表現(xiàn)之一?；颊咄ǔＴ谌檠榔诩窗l(fā)病，炎癥一直持續(xù)至恒牙期，最終可導(dǎo)致牙齒脫落。多數(shù)患者還可同時(shí)伴有掌跖、膝蓋等部位皮膚的角化異常。目前研究已經(jīng)證實(shí)，組織蛋白酶C基因（cathepsin C gene，CTSC）突變是PLS的致病基礎(chǔ)，但是具體機(jī)制尚不清楚。
　　組織蛋白酶C，又稱二肽肽

2、酶I（Dipeptidyl peptidase I，DPPI）是一類溶酶體半胱氨酸蛋白酶，參與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解?，F(xiàn)有的研究表明，組織蛋白酶 C對激活殺傷性T細(xì)胞（又稱細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，Cytotoxic T lymphocyte，CTL）中粒酶A和粒酶B，從而使CTL發(fā)揮正常的免疫功能有重要作用，因此CTSC突變導(dǎo)致的組織蛋白酶 C異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體抗感染能力減弱，從而引發(fā)和加重炎癥反應(yīng)。但是，關(guān)于組織蛋白酶C表達(dá)異常所造成

3、的PLS臨床病損為何會(huì)主要集中在牙周組織的破壞以及多部位上皮的角化異常，其原因和機(jī)制目前尚無合理解釋。探究組織蛋白酶C在牙周炎癥反應(yīng)中的功用，對于明確PLS的發(fā)病及牙周組織的自我保護(hù)機(jī)制具有重要意義。
　　研究目的：
　　1.觀察不同狀態(tài)下牙齦上皮細(xì)胞中組織蛋白酶C的表達(dá)差異，初步探討其與上皮細(xì)胞分化、免疫功能的關(guān)系；
　　2.通過基因敲除小鼠探討CTSC缺失對牙周組織炎癥反應(yīng)的影響，進(jìn)一步明確組織蛋白酶C在牙周組織炎

4、癥反應(yīng)中可能承擔(dān)的角色。
　　研究方法：
　　1.探究不同狀態(tài)下牙齦組織中組織蛋白酶C表達(dá)變化：
　　采用Real-time PCR方法檢測并比較健康牙齦、牙齦炎牙齦以及牙周炎牙齦組織中CTSC基因表達(dá)的差異；采用免疫組織化學(xué)法檢測并比較上述3種狀態(tài)下組織蛋白酶C表達(dá)的差異。
　　2.探究牙齦上皮組織中組織蛋白酶C表達(dá)變化與上皮細(xì)胞分化的關(guān)系：
　　利用免疫組化染色觀察比較人健康牙齦、牙齦炎牙齦以及牙周炎牙

5、齦的上皮分化相關(guān)指標(biāo)CK10、CK19的表達(dá)情況并分析其與相同狀態(tài)下組織蛋白酶C表達(dá)的相關(guān)性。
　　3.探究牙齦上皮組織中組織蛋白酶C的表達(dá)變化與上皮細(xì)胞免疫的關(guān)系：
　　利用免疫組化染色觀察比較人健康牙齦、牙齦炎牙齦以及牙周炎牙齦的 Toll樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）的表達(dá)情況并分析其與相同狀態(tài)下組織蛋白酶C表達(dá)的相關(guān)性。
　　4.建立小鼠牙周炎模型并觀察牙周炎癥反應(yīng)：
　　采

6、用向CTSC基因敲除C57小鼠和野生型C57小鼠的牙周組織局部注射大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）的方法建立小鼠切牙牙周炎模型及磨牙牙周炎模型。Micro-CT掃描，進(jìn)行切牙區(qū)牙槽骨體積以及磨牙區(qū)牙槽骨高度的變化量分析；HE染色觀察比較CTSC基因敲除鼠和野生型鼠牙周組織的炎癥水平，并進(jìn)行差異分析。
　　研究結(jié)果：
　　1. Real-time

7、 PCR結(jié)果顯示：
　　牙齦炎和牙周炎狀態(tài)下牙齦組織中 CTSC的表達(dá)量顯著高于健康狀態(tài)下牙齦組織中CTSC表達(dá)量；牙齦炎和牙周炎組織中CTSC基因的表達(dá)量未見明顯差異。免疫組化結(jié)果顯示：健康狀態(tài)下，組織蛋白酶 C在牙齦上皮中僅有散在地少量表達(dá)，而牙齦炎和牙周炎狀態(tài)下牙齦組織中組織蛋白酶 C的表達(dá)陽性率明顯增加，且表達(dá)位置主要位于牙齦上皮的基底上層，尤其是上皮表層表達(dá)最強(qiáng)，結(jié)締組織內(nèi)幾乎沒有組織蛋白酶C表達(dá)；牙齦炎和牙周炎組組織蛋

8、白酶C陽性表達(dá)細(xì)胞比例及表達(dá)強(qiáng)度無顯著差異。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示：
　　在牙周發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，伴隨 CTSC表達(dá)增高的同時(shí)，上皮細(xì)胞的分化發(fā)生了改變，CK19在基底上層出現(xiàn)散在的表達(dá)，CK10的表達(dá)則明顯增加，且與CTSC表達(dá)變化趨勢同步，提示組織蛋白酶C可能與上皮分化功能的改變有關(guān)。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示：
　　與CTSC的變化趨勢類似，在牙周炎癥時(shí)，TLR4在牙齦上皮的表達(dá)明顯增加，且主要集中于上皮

9、表層位置，提示組織蛋白酶 C可能與上皮免疫功能的發(fā)揮存在一定關(guān)系。
　　4.對CTSC基因敲除鼠和野生型鼠建模后，通過比較小鼠切牙區(qū)實(shí)驗(yàn)前后及磨牙區(qū)實(shí)驗(yàn)側(cè)和對照側(cè)牙槽骨的骨量及高度，結(jié)果令人驚訝。與人類不同，野生型鼠相比建模前，牙槽骨骨量及高度均發(fā)生了明顯的降低，而 CTSC基因敲除鼠未見明顯變化。HE染色結(jié)果顯示：野生型鼠牙周組織中有大量的炎性細(xì)胞浸潤，并且牙槽骨以及牙周膜纖維的破壞程度也明顯高于 CTSC基因敲除鼠。免疫組化結(jié)

10、果顯示：野生型鼠牙周組織中表達(dá)NF-κB的細(xì)胞數(shù)明顯多于CTSC基因敲除鼠。故，組織蛋白酶C缺失在小鼠牙周發(fā)生炎癥時(shí)，反而對牙周組織產(chǎn)生一種“保護(hù)”作用。
　　通過進(jìn)一步的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CTSC在人類和鼠的牙周組織中表達(dá)模式存在差異，人牙齦上皮的組織蛋白酶 C主要表達(dá)于基底上層，尤其是近表皮層；而在鼠牙齦組織中，組織蛋白酶C主要表達(dá)于上皮的基底層以及臨近基底的部分基底上層，表皮層未見明顯表達(dá)，這可能與CTSC基因敲除小鼠體內(nèi)出

11、現(xiàn)的牙周保護(hù)作用存在一定關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　1.組織蛋白酶C在炎癥狀態(tài)的牙齦上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明其在牙周組織的炎癥反應(yīng)中具有重要的作用。
　　2．組織蛋白酶C在牙齦上皮細(xì)胞中的表達(dá)變化，伴隨著細(xì)胞分化狀態(tài)和上皮細(xì)胞免疫狀態(tài)的改變。
　　3. CTSC基因缺失對小鼠炎癥刺激下誘導(dǎo)牙周組織發(fā)生破壞可能具有一定的“保護(hù)”作用，而CTSC基因缺失對人牙周炎癥反應(yīng)具有截然相反的影響，這種不同結(jié)局的造成可能與CT