廣州管圓線蟲宿主腸道侵襲：組織蛋白酶B樣半胱氨酸蛋白酶AC-cathB-1的功能初探.pdf

1、廣州管圓線蟲是引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎和腦膜腦炎的主要病原生物，該病也因此被命名為廣州管圓線蟲病。廣州管圓蟲屬于管圓線蟲屬，中間宿主為軟體動物，終末宿主為嚙齒類動物，人因誤食未煮熟的攜帶其第三期幼蟲(L3)的軟體動物而意外感染，L3污染的其他食物或水源也可導(dǎo)致感染。近年來，隨著人們飲食習(xí)慣的改變和水陸交通日趨發(fā)達(dá)，該病的流行呈上升趨勢。然而，我們在其診斷和治療方面仍缺乏有效手段，因此對其的進(jìn)一步研究很有必要。
　　小腸壁作為機(jī)

2、體防御病原體入侵的天然屏障之一，是大部分食源性且經(jīng)歷宿主體內(nèi)移行過程的寄生蟲必須逾越的屏障，廣州管圓線蟲也不例外。然而， L3究竟憑借什么能夠突破小腸粘膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中，其中的分子機(jī)制又是什么，對此我們?nèi)匀恢跎??？紤]到腸道實驗操作的不方便性以及每次實驗必須要犧牲動物，我們首先建立了一個廣州管圓線蟲-腸上皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型，期望用它來分析L3侵襲過程中與腸上皮細(xì)胞間發(fā)生的相互作用。在L3和宿主小腸上皮細(xì)胞發(fā)生的初始相互作用中，我們發(fā)現(xiàn)L

3、3識別小腸上皮細(xì)胞并攻擊它以造成機(jī)械損傷，同時通過釋放蛋白酶及其他相關(guān)分子來打開上皮細(xì)胞層的緊密連接和擴(kuò)大相鄰細(xì)胞間的間隙以便于屏障穿越，但不引起細(xì)胞凋亡的增加。
　　盡管我們已經(jīng)初步了解L3是依靠哪些方式穿透腸壁，但對于涉及其中的分子機(jī)制，特別是相關(guān)關(guān)鍵基因還還不甚了解。組織蛋白酶B是一類廣泛分布的半胱氨酸蛋白酶，與哺乳動物中通常分布于溶酶體中不同，它在寄生蟲中通常是一種分泌蛋白，被認(rèn)為與寄生蟲的致病、組織入侵、體內(nèi)移行、營養(yǎng)攝

4、取和免疫逃避等重要過程有關(guān)。本室前期克隆的AC-cathB-1基因是一種組織蛋白酶B樣半胱氨酸蛋白酶。實時定量PCR結(jié)果顯示，它在L3中表達(dá)量明顯高于第一期幼蟲(L1)、第五期幼蟲(L5)和成蟲，因此我們選擇它作為目標(biāo)基因研究其在L3感染宿主過程中的作用。
　　不同物種間，或同一物種中的不同組織蛋白酶B在理化性質(zhì)、分布和功能方面各不相同，它們的表達(dá)情況總是和其功能相關(guān)。我們將AC-cathB-1基因構(gòu)建入原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了大量原

5、核表達(dá)重組蛋白，并制備了AC-cathB-1蛋白抗血清。利用抗血清，我們考察了AC-cathB-1蛋白在L3上的定位，發(fā)現(xiàn)它在體壁、食道和腸道表達(dá)，說明它可能參與到L3的蛻皮和營養(yǎng)攝取過程;另外，在排泄管中也有明顯陽性信號，說明它可能被釋放到機(jī)體外起作用。Western印跡實驗結(jié)果顯示，L3分泌排泄產(chǎn)物(ESP)樣品中有AC-cathB-1蛋白，綜合前期結(jié)果我們確證該蛋白為L3的ESP組成成分，參與寄生蟲宿主的相互作用。實時定量PCR結(jié)

6、果顯示，大鼠組織提取物能誘導(dǎo)AC-cathB-1基因mRNA水平的上調(diào)，說明該基因在此過程中可能是效應(yīng)基因。
　　原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物通常缺乏必要的修飾，因此我們利用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)獲得了具有生物學(xué)活性的重組蛋白。AC-cathB-1重組蛋白以低水解活性的蛋白酶原形式存在，需要通過加工激活形成成熟蛋白酶而發(fā)揮作用。我們發(fā)現(xiàn)在胃蛋白酶存在的情況下，AC-cathB-1重組蛋白被切出略小于35kD的肽段，且水解熒光底物的能力升高了7倍

7、以上，說明胃液可以激活L3 ESP中的AC-cathB-1。通過梯度pH值實驗，我們發(fā)現(xiàn)該蛋白酶在pH6.0有最高活性，而在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中活力低下。
　　寄生蟲的蛋白酶類在宿主組織穿越過程中的作用主要體現(xiàn)在其具有降解細(xì)胞外基質(zhì)組分的酶學(xué)活性。我們的結(jié)果顯示，激活的重組AC-cathB-1可以降解細(xì)胞外基質(zhì)組分纖連蛋白、層粘連蛋白，但對Ⅰ型膠原蛋白不起作用;明膠酶譜實驗顯示它具有水解明膠的活性。因此我們推測它參與到L3對宿主腸壁的穿

8、越過程。為了驗證這一推測，我們將激活的重組AC-cathB-1添加到貼壁培養(yǎng)的IEC-6細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙顯著增大;而與蛋白酶孵育3 h后的大鼠小腸也顯示了上皮細(xì)胞自基底膜脫落的表型。這說明，AC-cathB-1蛋白確實可以破壞大鼠的小腸組織。
　　因為缺乏有效的遺傳修飾手段，寄生線蟲特定基因的功能研究進(jìn)展緩慢。近年來，RNA干擾技術(shù)為我們提供了一種選擇，然而在廣州管圓線蟲上還沒有成功的應(yīng)用。哺乳動物細(xì)胞研究中常用特異抗體封閉分

9、泌型配體和受體間的相互作用，因其基于抗原抗體的相互作用而具有特異性。我們借鑒這一方法，使用抗血清封閉AC-cathB-1重組蛋白的活性，抑制效率達(dá)到了78.7％?？寡孱A(yù)處理的L3對體外屏障模型和大鼠離體小腸袋的穿透能力均顯著降低，說明該蛋白確實在L3的宿主腸壁穿越過程中有重要作用。
　　綜上所述，本文首先構(gòu)建了寄生蟲-上皮細(xì)胞相互作用模型，并借此研究了廣州管圓線蟲L3侵襲小腸上皮細(xì)胞的具體模式。接著，我們探討了特定基因AC-ca